TDM/TDB是結核亞單位疫苗的重要佐劑

孫 蕾 鄭錦輝 戚 巍 唐詩邈 綜述 郭軍巧 審校 (遼寧省疾病預防控制中心，沈陽110005)

結核病是嚴重危害人類健康的慢性傳染病，每年造成全球二百萬人死亡[1]，我國結核病患者人數僅次印度，位于世界第二位。我國結核病的耐藥狀況不容樂觀，耐多藥結核分枝桿菌的出現給結核病的防治帶來巨大的挑戰[2]。在多數高負擔的發展中國家，由于環境中的細菌長期誘導低水平的抗菌免疫，卡介苗(BCG)缺乏有效性，急需研制有效的結核疫苗控制結核疫情[3]。重組結核蛋白亞單位疫苗Ag85B-ESAT6(H1)正是一種極具前景的新型疫苗。H1是 MTB蛋白Ag85B和ESAT6的融合物[1]，H1有效誘導抗菌免疫需要使用能活化抗原提呈細胞(APC)的佐劑。氧化鋁能誘導抗體產生，但對控制細胞內感染的T細胞應答無效。弗氏完全佐劑(CFA)能有效誘導Th1細胞活化，但毒性太大。索因子正6，6-二霉菌酸海藻糖(TDM)及其合成類似物6，6-二十二酸酯海藻糖(TDB)是結核亞單位疫苗的有效佐劑[4，5]，能與重組H1疫苗共同誘導較強的Th1免疫應答。糖脂佐劑TDM/TDB通過活化固有免疫應答啟動Th1和Th17免疫機制的研究對于充分發揮疫苗的保護作用具有重要意義。TDM/TDB作用于APC的信號轉導途徑和發揮免疫刺激活性的分子機制成為疫苗研制的關鍵。

1 TDM/TDB激活固有免疫程序，活化Th1和Th17細胞功能

哺乳動物免疫包含兩個系統，即固有免疫系統和適應性免疫系統。固有免疫作為防御的第一道防線，幾分鐘內快速發現、識別病原體，未成熟的抗原提呈細胞吞噬、攝取抗原，同時與佐劑的病原體相關分子模式(PAMPs)接觸而成熟，進而提呈抗原并活化初始 T細胞，啟動抗原特異的獲得性免疫應答[6]。

1.1 TDB/TDM有效活化抗原提呈細胞(APCs)佐劑TDB/TDM能有效活化APC，誘導獲得性免疫。TDB能上調APC表面MHCⅡ分子和共刺激分子CD40、CD80和CD86的表達，刺激樹突狀細胞(DCs)和骨髓源巨噬細胞(Bone marrow-derived macrophage，BMMs)合成細胞因子和一氧化氮(NO)[5]。采用骨髓源巨噬細胞的合成物NO作為細胞活化的標志，TDB/TDM能誘導骨髓源巨噬細胞合成大量NO。與TLR配體CpG對TLR刺激相比，佐劑TDB通過特定的細胞內信號系統活化APCs。TDB選擇性誘導基因表達已在蛋白水平被證實，在細胞培養物的上清中能檢測到TDB刺激合成的白介素1β(IL-1β)[5]。活化的DC其功能得到增強。

1.2 TDM/TDB促進Th1和Th17細胞合成γ-干擾素和IL-17 為進一步確定TDB佐劑誘導獲得性免疫的活性，用H1與TDB刺激淋巴結細胞Th1和Th17細胞應答。TDB誘導強Th1細胞應答，強烈誘導抗原特異性γ-干擾素的合成[7]，也能活化強Th17細胞應答[8]。TDB免疫刺激能力主要依賴其對固有免疫系統的作用[5]。

2 TDM/TDB增強APC功能的分子機制

2.1 TDB/TDM誘導APC活化需要酪氨酸激酶SyK 多種模式識別受體(PRRs)通過不同的信號途徑調節髓系細胞活性。多數TLR(Toll-like receptor)通過銜接蛋白MyD88傳遞信號[9]，免疫受體酪氨酸活化基序(ITAM)相連受體如C型凝集素受體采用激酶Syk作為下游信號。為了解TDB通過哪條信號轉導途徑活化細胞，采用 MyD88-/-和 Syk-/-BMMs觀察TDB對細胞的活化作用。在反應體系中加入TLR受體活化劑后，Syk-/-細胞正常合成NO，MyD88-/-BMMs活化受抑制。相反，TDB/TDM誘導MyD88-/-細胞合成NO不受影響，但不能刺激Syk-/-細胞合成NO。TDB免疫后，MyD88-/-BMMs表達白介素6(IL-6)不受影響，而Syk-/-BMMs不能合成IL-6和IL-1β。小分子Syk抑制劑以劑量依賴的方式阻礙TDB/TDM誘導BMMs合成釋放NO[5]。因此，Syk的酶功能對 TDB/TDM 誘導非MyD88-/-依賴固有免疫細胞體外活化是很重要的。

2.2 銜接分子Card9是TDM/TDB發揮佐劑活性的重要分子 TDM/TDB活化巨噬細胞或樹突狀細胞需要髓系細胞特異銜接蛋白Card9。TDB免疫后，Card9-/-細胞不能合成NO和上調誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、IL-6和IL-1β的表達。而CpG刺激Card9-/-細胞后，這些分子的表達在很大程度上不受影響。凝膠多糖(Curdlan)是C型凝集素受體Dectin-1的配體，由Card9傳遞信號。TDB和Curdlan刺激DCs合成IL-12p40、IL-12p70和 IL-12p23依賴于 Card9。在Card9缺乏的條件下，TDB和Curdlan誘導細胞活化的能力完全喪失，而CpG活化基因表達的能力不受影響。通過分析 DCs分泌 IL-1β、IL-6和 TNF-α發現，TDB嚴格地以Card9依賴的方式激發核轉錄因子NF-κB的核移位[5]，Card9與下游銜接分子和支架蛋白BCL10和 Malt1結合，促進 NF-κB活化，誘導巨噬細胞分泌細胞因子[10]。因此，上述實驗證明TDB、TDM在基因轉錄水平上調節固有免疫，這一途徑依賴Syk激酶活化和銜接蛋白Card9、Bcl10和Malt1。

2.3 TDB/TDM需要ITAM受體-銜接蛋白FcRr識別 TDB/TDM不依賴Dectin-1受體激活APC，但需要ITAM受體-銜接蛋白FcRr識別。用Curdlan不能刺激 Dectin-1-/-BMMs合成 NO，但 TDB、TDM、CpG和LPS不受影響，因此，TDB/TDM不依賴Dectin-1受體激活APC。活化Syk的髓系細胞受體與銜接蛋白Dap12或FcRr之一有關[9]。為進一步了解TDB/TDM活化 APC所需的信號分子，使用Dap12-/-BMMs和 FcRr-/-BMMs。TDB/TDM 刺激后，FcRr-/-BMMs表達的一氧化氮合酶2(Nitric oxide synthase2，NOS2)和合成的NO特異喪失，TDB/TDM誘導 NOS2的表達不依賴于 Dap12。TDB/TDM誘導大量的IL-6表達特異需要FcRr。因此，ITAM受體相關銜接蛋白FcRr對于TDB/TDM識別Syk-Card9信號途徑是至關重要的[5]。

2.4 TDB/TDM與ITAM受體的特異結合 目前，特異識別TDB/TDM的受體已被查明，一些C型凝集素受體(Mincle、Dectin-2和 DCAR)，還有其它FcRr偶聯蛋白(OSCAR和PIRA)被認為是候選受體[7]。其中，Mincle-Fc融合蛋白成劑量依賴的與TDM和TDB特異結合，說明細菌來源的糖脂TDM和TDB是Mincle受體的配體[11]。TDM由一個海藻糖和兩個霉菌酸鏈組成。兩者均不能單獨激活表達Mincle受體的細胞，這表明TDM的糖脂結合對于TDM與Mincle受體相互作用起到關鍵作用。TDM/TDB能上調C型凝集素受體Mincle在巨噬細胞中的表達，用定量RT-PCR檢測Mincle mRNA發現，TDM/TDB誘導的Mincle上調完全依賴于FcRr和Card9。Mincle受體識別結核分枝桿菌(MTB)的活性需要受體中糖類識別區域的EPN基序[12]。細菌索因子TDM或合成類似物TDB與Mincle受體結合，巨噬細胞表面的Mincle受體交聯，活化Mincle-FcRγ復合體，因此，與FcRr相結合的Mincle受體與糖脂TDB和TDM結合是激活巨噬細胞的必要條件，也是TDB和TDM發揮佐劑活性的關鍵。

總之，糖脂佐劑TDM和TDB與含免疫受體酪氨酸活化基序(ITAM)的受體結合，ITAM受體-銜接蛋白FcRr復合體活化，由FcRγ傳遞激活信號，通過Syk-Card9-Bcl10-Malt信號途徑將膜受體活性轉換為下游信號，促進NF-κB活化，通過胞質的信號級聯反應途徑激活APC。FcRr相結合的ITAM受體與糖脂TDB和TDM結合是激活APC的必要條件，也是TDB和TDM發揮佐劑活性的關鍵。

3 銜接分子Card9是TDB/TDM發揮佐劑活性的關鍵

為了解Card9是否為亞單位疫苗H1和TDB誘導免疫保護所必需，用低劑量的MTB氣溶膠感染小鼠，6周后檢測肺組織中細菌量。含H1和TDB脂粒的疫苗可以使感染鼠肺部細菌的量明顯減少，而單獨H1脂粒疫苗沒有明顯效果。與對照相比，TDB和H1免疫不能減少Card9-/-鼠肺部細菌的集落數。證明在體內Card9在TDB誘導的抗結核免疫中發揮重要作用，這種保護作用與Card9依賴的抗原特異Th17細胞活化有關，與H1特異的合成γ-干擾素的CD4+T細胞數量的增加無關[5]。

Card9-/-鼠選擇性的髓系細胞缺陷，淋巴細胞活性不受影響。在脂粒中僅加入H1疫苗注射后，對照鼠和Card9-/-鼠均出現短暫的腳掌腫脹。用含有H1疫苗和TDB/TDM的脂粒注射后，對照鼠腳掌迅速變厚，而Card9-/-鼠無變化。TDM或TDB誘導Card9-/-鼠淋巴細胞合成γ-干擾素的能力減弱，暗示 TDB/TDM誘導 Th1細胞分化依賴于Card9。TDB/TDM誘導Card9-/-鼠淋巴細胞合成H1特異的IL-17的能力完全缺失，表明Card9在TDM/TDB誘導 Th17細胞分化中起關鍵作用[5]。因此，Card9是體內TDB和TDM發揮佐劑活性必需的。

4 結語與展望

佐劑是絕大多數疫苗的組成成分，并發揮重要的免疫調節作用。細菌索因子TDM和其類似物TDB能活化固有免疫細胞，誘導適合的、保護性的Th1和Th17反應。用含佐劑TDM的亞單位疫苗免疫后，誘導的Th17細胞水平與MTB刺激機體產生的免疫程度相一致。

佐劑TDM/TDB與抗原提呈細胞(APC)表面受體相結合，通過細胞內信號轉導途徑活化APC，分泌IL-1β、IL-6和IL-23等細胞因子，這些細胞因子作為細胞免疫應答的第三信號共同誘導Th17分化[13，14]。TDM 和 TDB 通過 Syk-Card9 信號調節免疫保護機制是發展有效TB免疫戰略的基礎。對TDM、TDB佐劑活化固有免疫細胞分子機制及信號傳導途徑的研究使通過特異抗體調節疫苗反應成為可能，對充分發揮疫苗功能和控制結核具有重要意義。

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