黑曲霉對菲共代謝降解的影響

侯雪敏， 臧淑艷， 李盼盼， 王 娟， 秦曉龍， 林 樂

(沈陽化工大學應用化學學院，遼寧沈陽110142)

多環芳烴是一類廣泛存在于環境中的有機污染物，其主要來源為礦物燃料不完全燃燒及火山活動等，也是最早被發現和研究的化學致癌物.菲是典型的多環芳烴類有機污染物之一，具有毒性大和降解性較差等特點.含菲廢水主要來源于酸性礦山廢水，而酸性礦山廢水主要來自于礦井水、選煤廢水、焦化廠廢水等.這些礦山廢水排放量大，持續性強，排放地點分布廣泛，不易控制與處理，對環境的污染十分嚴重.因此，處理廢水中的菲成為當今的熱點問題，有研究報道［1－2］國內某些重要水域已受到不同程度的污染.

針對難降解的高濃度有機污染物的工業廢水，必須采取科學和先進的技術方法進行處理.這些處理技術主要有物理法、化學法和微生物法［3］.微生物法是國內外處理酸性廢水的最新方法，這種方法有成本低、適用性強、無二次污染等優點，成為國內外研究的熱點［4－8］.而針對傳統方法所確定的微生物難降解物質有必要將共代謝作用考慮在內.共代謝過程提出了一種新的代謝現象，而且降解主要是真菌、細菌等.魏明寶［9］等人以蒽為代表研究了環境微生物對其降解過程.祝儒剛［10］等人對分離的菌株進行了培養條件的優化和對不同濃度菲降解率的測定.許麗［11］等人研究了細菌對多環芳烴的降解能力.胡順利［12］等人研究了降解菲方面生物的可利用性.文獻［13－15］在不同情況下研究了共代謝對微生物降解速率的影響.本實驗將微生物降解作用與共代謝作用相結合，利用真菌黑曲霉降解模擬廢水中的多環芳烴菲，對實驗條件進行探討.

1 實驗部分

1.1 儀器及材料

1.1.1 主要儀器

FT-IR470型紅外光譜儀，美國Nicolet公司; HZQ-C雙層氣浴振蕩器，金壇市杰瑞爾電器有限公司;YXQ-LS-18SI型自動手提式滅菌器，上海博訊實業有限公司醫療設備廠;SW-CJ-1D(1G)型單人凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司等.

1.1.2 主要試劑

菲、丙酮，分析純，天津市北方化工購銷中心;二氯甲烷，分析純，沈陽市億泰貿易有限公司;水楊酸、鄰苯二甲酸，分析純，沈陽萊博貿易有限公司;琥珀酸鈉，分析純，沈陽國藥化學試劑有限公司;乙酸乙酯，分析純，康科德科技有限公司;蔗糖，分析純，哈爾濱市化工試劑廠等.

1.1.3 菌種來源

實驗選用的真菌黑曲霉來自中國科學院生態研究所.

1.1.4 培養基的制備

馬鈴薯培養基:馬鈴薯200 g，去皮，切成小塊，加蒸餾水1 000 mL，煮沸30 min，過濾，濾液定容到1 000 mL，加蔗糖20 g.

無機鹽培養基:NH4NO3，1 g;MgSO4·7H2O，0.2 g;CaCl2·2H2O，0.01 g;FeSO4·7H2O，0.01 g;KH2PO4，0.4 g;Na2HPO4·12H2O，0.6 g;葡萄糖，0.5 g;蒸餾水1 L.

1.2 實驗方法

1.2.1 菲含量的測定方法

分別配置體積分數為0、0.5×10－6、1× 10－6、1.5×10－6、2×10－6、2.5×10－6、3×10－6、4×10－6、5×10－6、8×10－6的標準溶液，使用紫外分光光度計測量樣品Abs，根據Lambert-Beer定律:A=εbc，光譜帶寬1 nm，取樣間隔1 nm，在253 nm處記錄吸光度，保存數據，繪制曲線.

1.2.2 真菌黑曲霉生長曲線

將配置好的馬鈴薯培養基精確分裝于16個250 mL錐形瓶中，每瓶50 mL，在無菌室將培養24 h的黑曲霉菌接到錐形瓶中，在搖床中培養5 d.用電子天平對烘干后的每張稱量紙進行稱質量，每6 h取2個平行樣進行過濾、烘干、稱質量，計算每6 h黑曲霉質量凈增情況，繪制出黑曲霉生長曲線.

1.2.3 菲初始體積分數對降解的影響

配置體積分數為20×10－6、60×10－6、100× 10－6、140×10－6、180×10－6菲的溶液，然后每個錐形瓶接入體積分數10%黑曲霉，用紗布封好口放入搖床，培養5 d.過濾，用二氯甲烷萃取，定容.每份3個平行樣，使用紫外分光光度計測量樣品在253 nm處的吸光度，計算菲降解率.

1.2.4 不同共代謝底物對菲降解的影響

先按無機鹽培養基配方配制1 000 mL培養基，精確分裝5份于250 mL錐形瓶中，每份200 mL，之后分別稱取水楊酸、琥珀酸鈉、磷苯二鉀酸、萘，使其與菲的體積比為1∶5，配制體積分數100×10－6菲溶液，然后每個錐形瓶接入體積分數10%上述培養的黑曲霉，每份3個平行樣，用紗布封好口放入搖床，培養5 d.過濾，用二氯甲烷萃取，定容.使用紫外分光光度計測量樣品吸光度，計算菲降解率.

1.2.5 菲與共代謝底物的最佳濃度比

先按無機鹽培養配方配制1 000 mL培養基，精確分裝5份于250 mL錐形瓶中，分別配置體積分數為0、20×10－6、60×10－6、100×10－6、140×10－6珀酸鈉溶液，每個錐形瓶放入0.020 0 g菲(即體積分數100×10－6菲溶液)，然后每個錐形瓶接入體積分數10%、培養24 h的黑曲霉，每份3個平行樣，入搖床.培養5 d.過濾，用二氯甲烷萃取，定容.使用紫外分光光度計測量樣品吸光度，計算菲降解率.

1.2.6 酸度對菲共代謝降解的影響

將1 000 mL無機鹽培養基精確分4份裝于250 mL錐形瓶中，配制出體積分數100×10－6菲溶液及琥珀酸鈉溶液，調節每個錐形瓶pH值，使4瓶pH值分別為5.0、6.0、7.0、8.0，然后每個錐形瓶接入體積分數為10%的黑曲霉，每份3個平行樣，用紗布封好口放入搖床.設定搖床溫度28℃，轉速為150 r/min，培養5 d.過濾，用二氯甲烷萃取、定容.測樣:使用紫外分光光度計測量樣品吸光度，計算菲降解率.

2 結果與討論

2.1 菲檢測標準曲線

由圖1可知:線性方程為 y=0.340 6x+ 0.009 5，其中R2=0.998 8.當菲體積分數在0～8×10－6之間時，菲的吸光度呈良好直線形狀，因此，之后測定菲濃度時用此菲的標準曲線，濃度太高則進行稀釋，太低則進行濃縮.

圖1 菲溶液的標準曲線Fig.1 Standard curve of phenanthrene solution

2.2 真菌黑曲霉生長曲線

從圖2可以看出:黑曲霉在前12 h生長緩慢，從12 h到30 h生長極其迅速，成對數生長期，30 h后黑曲霉長勢基本處于穩定狀態，因此，黑曲霉最佳生長時間為30 h.

圖2 黑曲霉的生長曲線Fig.2 Growth curve of the aspergillus niger

2.3 菲起始濃度對降解的影響

菲起始濃度對降解的影響如圖3所示.

圖3 菲起始體積分數對降解的影響Fig.3 Effect of initial concentration of phenanthrene on the degradation

由圖3可知:起始濃度對菌株生長的影響較為明顯.在一定范圍內，隨著菲起始濃度升高，有利于微生物降解，當菲體積分數達到100×10－6時，菲的降解率達到最高，但是隨著菲濃度繼續增大時，降解率隨之降低.這可能是因為開始時未達到微生物的毒性耐受限度，當菲濃度過高的時候，菲毒性增大，達到微生物耐受限度，導致真菌活性降低，因此，真菌對菲的降解率降低.所以菲溶液的最佳體積分數為100×10－6.以下實驗菲濃度均采用體積分數100×10－6.

2.4 不同共代謝底物對菲降解的影響

對比圖3可以看出:在有共代謝底物的存在下，降解率有明顯提高.由圖4可以看出，共代謝底物對降解率影響:萘＜鄰苯二甲酸＜水楊酸＜琥珀酸鈉，并且可以看出琥珀酸鈉可以最大程度地提高菲的降解率.這可能是因為向廢水中加入代謝中間產物能提高微生物酶的活性，而琥珀酸鈉更好地提高了某些可誘導酶活性，使菲更具有親和力，因此，能被迅速降解，促進共代謝降解過程.因此，選擇琥珀酸鈉作為共代謝的一級基質較好.

圖4 不同共代謝底物對菲降解率的影響Fig.4 Influence of different metabolic substrate on the degradation of phenanthrene

2.5 菲與共代謝底物的最佳濃度比

圖5可知:隨著琥珀酸鈉濃度升高，菲的降解率隨之升高，當琥珀酸鈉體積分數達到100× 10－6時，菲的降解率達到最高，在體積分數為140×10－6時下降.這可能是因為琥珀酸鈉濃度在一定范圍內為黑曲霉提供了良好的碳源，由于琥珀酸鈉和菲有相似的結構，使黑曲霉在降解琥珀酸鈉的同時所分泌的酶很好地降解了菲;但是，當琥珀酸鈉體積分數大于100×10－6時，即達到140×10－6，菲和琥珀酸鈉有競爭關系，琥珀酸鈉毒性更小，比較容易降解，使菲的降解率有所降低.所以，在實驗中作為共代謝底物的琥珀酸鈉最佳體積分數為100×10－6，以下實驗琥珀酸鈉體積分數均采用100×10－6，即菲與琥珀酸鈉最佳體積分數比為1∶1.

圖5 不同琥珀酸鈉體積分數對菲降解率的影響Fig.5 Influence of different succinic acid sodium concentration on the phenanthrene degradation

2.6 酸度對菲共代謝降解的影響

由圖6可知:在pH值為5.0、8.0時，酸度對菲共代謝降解率變化影響不大，最佳pH范圍是6.0～7.0.其原因可能是微生物更適合于弱酸性，在pH6.0～7.0左右時，微生物酶活性大大提高，使菲的降解率增大;當趨于堿性時，微生物酶活性受到抑制，降解率降低.最佳pH范圍在6.0～7.0.

圖6 不同pH值對菲降解率的影響Fig.6 Effect of different pH on the phenanthrene degradation

3 結論與展望

實驗主要研究了優勢真菌黑曲霉對模擬的含菲廢水降解作用，主要結論如下:

(1)通過黑曲霉生長曲線的實驗可知黑曲霉的最旺盛生長時間為30 h.

(2)通過對菲濃度的選擇，得出黑曲霉降解菲的最佳體積分數為100×10－6.

(3)通過對不同共代謝底物的實驗，得出最佳共代謝底物為琥珀酸鈉.

(4)對不同的一級基質與二級基質的體積分數比實驗，得出體積分數比為1∶1時效果較好.

(5)通過進行酸度對共代謝影響的實驗，得到pH值在6.0～7.0左右，降解率最高.

由于時間和實驗條件的關系，諸多新發現和新設想還未來得及進一步的驗證.在今后的實驗研究中，應把對降解產物的結構、特點及毒理性質的研究作為重點，從而選擇降解方法和途徑.

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