大孔吸附樹脂純化桑黃總黃酮工藝

孫錦秀

桑黃(Phellinus vaninii Ljub)屬擔(dān)子菌亞門(Basidiomcota)，層菌綱(Hymenomycetes)，多孔菌科(Polyporaceae)，木層孔菌屬(Phellinus)［1］。最新研究表明，桑黃具有抗腫瘤、抗炎、抗血管生成活性等多種藥理作用［2-4］，主要含有可溶性多糖、三萜和黃酮等活性成分［5］，是少有的含有活性黃酮化合物的藥用真菌。桑黃總黃酮成分是其抗氧自由基的主要活性部位［6］，目前對桑黃總黃酮分離純化的系統(tǒng)研究很少。本文應(yīng)用大孔樹脂對桑黃總黃酮進(jìn)行純化富集，優(yōu)選最佳工藝條件。

1 實驗儀器和材料

1.1 主要儀器 KQ-250B超聲波清洗儀(昆山市聲儀器有限公司)，R2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國Buchi公司)，UV-2401紫外可見分光光度計(日本島津公司)，D100B恒流泵(上海青浦滬西儀器廠)。

1.2 試藥 桑黃(楊樹桑黃)，延吉市長白山特產(chǎn)經(jīng)營部;蘆丁對照品(含量≥98%)，南京澤朗植提有限公司，批號:ZL20111108;AB-8大孔吸附樹脂(含酯基的苯乙烯聚合物，非極性)、D101大孔吸附樹脂(苯乙烯聚合物，非極性)、NKA-9大孔吸附樹脂(苯乙烯聚合物，極性)，天津南開和成化工有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 桑黃總黃酮粗提物的制備 準(zhǔn)確稱取15 g桑黃子實體粉末(過60目篩)，置燒瓶中，加70%乙醇450 mL，室溫下浸泡 12 h后，超聲提取30 min，抽濾，殘渣再超聲提取1次，合并2次濾液，濃縮烘干，得到桑黃醇提物粗品。

2.2 含量測定

2.2.1 溶液配制 對照液:準(zhǔn)確稱取蘆丁對照品25 mg，70%乙醇溶解定容至50 mL;AlCl3液:含水AlCl31.8 g，70%乙醇溶液定容至100 mL;樣品液:準(zhǔn)確稱取桑黃醇提物17.3 mg，70%乙醇定容至25 mL。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密吸取對照液0、0.8、1.6、2.4、3.2、4.0 mL，置50 mL量瓶，分別加AlCl3液4.0 mL和去離子水15 mL，70%乙醇定容，30℃水浴10 min，室溫放置20 min后，408 nm處測吸光度。得線性回歸方程:A=0.026 3 C+0.009 7 (r=0.999 8)，蘆丁濃度在8～40 μg/mL范圍內(nèi)線性良好。

2.2.3 樣品總黃酮含量測定 精密吸取樣品液1.5 mL，同“2.2.2”項下操作，桑黃粗提物中總黃酮含量為464.5 mg/g。

2.3 純化工藝考察

2.3.1 樹脂預(yù)處理 取一定量樹脂，95%乙醇溶劑浸泡24 h，濕法裝柱，95%乙醇洗脫，控制流速，洗至流出液與水1∶2混合不產(chǎn)生渾濁后，水洗至無醇味，3柱體積(BV)的3%鹽酸溶液浸泡3 h，用水洗至中性，再用3 BV的3%氫氧化鈉溶液浸泡3 h，水洗至中性。

2.3.2 樹脂的選擇 精密稱取 D101、AB-8、NKA-9樹脂各5.0 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，加入總黃酮含量為2.064 mg/mL的桑黃粗提物溶液(C0)45 mL，置搖床室溫下振搖24 h，取上清液，測其總黃酮含量(C1)。取出吸附飽和的樹脂，吸干表面水分，加70%乙醇45 mL，室溫下振搖24 h，再取上清液，測其總黃酮含量(C2)。以飽和吸附量和解吸率為考察指標(biāo)，觀察各樹脂的吸附性能。飽和吸附量Q=(C0-C1)×V/W，W為樹脂質(zhì)量(g);解吸率(%)=C2/(C0-C1)×100%。結(jié)果見表1，選擇AB-8為桑黃粗提物的純化樹脂。

表1 三種大孔樹脂的吸附性能比較

2.3.3 pH值對吸附的影響 取5.0 g預(yù)處理的AB-8大孔樹脂置于 50 mL具塞錐形瓶中，加2.064 mg/mL桑黃粗提物溶液45 mL，用鹽酸或者NaOH調(diào)節(jié)溶液pH值分別為4、5、6、7、9。室溫下振蕩24 h。取上清液測定總黃酮含量，計算室溫下的樹脂靜態(tài)吸附量。見圖1。

圖1 pH值對樹脂飽和吸附率量的影響

由圖1可見，pH為5時，樹脂靜態(tài)飽和吸附量最大，可能由于桑黃中的黃酮類化合物為多羥基酚類，呈弱酸性，在酸性條件下呈分子狀態(tài)，以氫鍵方式被吸附，酸性過強(qiáng)，黃酮類化合物易生成烊鹽，使吸附效果變差;堿性增大則使酚羥基上的氫解離形成酸根離子，樹脂的結(jié)合減弱，從而使吸附量降低。桑黃醇提物溶液pH值介于5和6之間，因此，本實驗不另加緩沖鹽。

2.3.4 上樣濃度考察 稱取0.3、0.5、0.7、0.9、1.1 g桑黃總黃酮粗提物，用70%乙醇30 mL超聲溶解，加水稀釋至100 mL作為上柱液，計算總黃酮含量(C0)。AB-8大孔樹脂50 g濕法裝柱(φ 2.4 cm，300 mm，徑高比1∶10)，分別用1 BV去離子水和5 BV 70%乙醇洗脫，乙醇洗脫液濃縮后定容至100 mL，測總黃酮含量(C2)，計算洗脫率，洗脫率(%)=C2/C0×100%，見圖2。

圖2 上樣濃度考察

由圖2可見，上樣濃度較小時，效率較低，由于死吸附等損耗，使洗脫率降低;當(dāng)上樣濃度達(dá)到5 mg/mL(黃酮含量2.323 mg/mL)時，變化很小。濃度越大越容易出現(xiàn)沉淀，導(dǎo)致柱層析堵塞，使流速變慢，所以選擇上樣濃度為5 mg/mL。

2.3.5 泄露曲線 取粗提物濃度5 mg/mL上柱液上柱，每10 mL收集1個流份，于378 nm波長處測吸光度。見圖3。

圖3 AB-8大孔樹脂的動態(tài)吸附泄漏曲線

從圖3可見，上柱液量少時，流出液吸光度較小;當(dāng)上柱液達(dá)到30 mL時，桑黃黃酮開始出現(xiàn)泄漏，隨著流出液體積的增加，流出液的吸光度逐漸增大。當(dāng)流出液體積增至100 mL時，達(dá)到吸附平衡，流出液吸光度不再發(fā)生變化。

2.3.6 洗脫劑濃度考察 取粗提物濃度5 mg/mL上柱液100 mL上柱，1 BV去離子水洗，再分別用5 BV的30%、50%、70%、90%乙醇溶液洗脫。洗脫液濃縮干燥后稱重，測定總黃酮含量，計算得率:得率(%)=上柱的粗提物的重量/純化后的質(zhì)量。見表2。表2顯示，90%醇洗脫所得總黃酮含量高，但得率較低;70%醇洗脫黃酮含量與90%醇洗脫接近，但得率較高。綜合考慮，70%醇為最佳洗脫劑濃度。

表2 洗脫劑濃度影響

2.3.7 流速考察 取粗提物濃度5 mg/mL上柱液100 mL上柱，1 BV去離子水洗，再以5 BV 70%乙醇洗脫，恒流泵控制流速分別為1、2、3 BV/h。洗脫液濃縮干燥后稱重，計算得率。分別為73.23%、70.72%、62.18%。流速越慢洗脫越完全;過快會減少被吸附物質(zhì)和樹脂的接觸時間，進(jìn)而影響吸附效果，洗脫不完全;而流速過慢，會延長生產(chǎn)周期，同時滯留在樹脂中的雜質(zhì)較多，再生困難，縮短樹脂使用壽命。綜合考慮選擇流速2 BV/h。

2.3.8 樹脂再生 AB-8大孔樹脂每使用一次后，用95%乙醇洗至無色，然后用水洗去乙醇即可使用。但多次反復(fù)使用后，樹脂顏色變深，吸附量下降，所以樹脂使用數(shù)次后必須再生:3 BV 3%鹽酸溶液浸泡3 h，用水洗至中性，再用3 BV 3%氫氧化鈉溶液浸泡3 h，水洗至中性。

3 討論

3.1 桑黃總黃酮提取物紫外掃描的最大吸收峰在378 nm，加 AlCl3絡(luò)合后最大吸收峰移至408 nm，提高了專屬性。

3.2 根據(jù)上述結(jié)果，大孔樹脂純化富集桑黃總黃酮的最佳工藝:AB-8大孔樹脂50 g濕法裝柱(φ 2.4 cm，300 mm，徑高比1∶10)，5 mg/mL桑黃粗提物溶液100 mL上樣，1 BV水洗后以5 BV 70%乙醇洗脫，流速2 BV/h，乙醇洗脫液干燥濃縮得到精制桑黃總黃酮。

［1］ 戴玉成，圖力古爾.中國東北野生食藥用真菌圖志［M］.北京:科學(xué)出版社，2007:164-166.

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