發(fā)病前后應(yīng)用丁苯酞對SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因鼠影響的比較

陰均濤， 張紅麗， 閆 欣， 王亞飛， 劉亞玲

肌萎縮側(cè)索硬化癥(Amyotrophic lateral sclerosis，ALS)是一種累及上、下運動神經(jīng)元的慢性神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性加重的肌肉萎縮、肌無力，最終因呼吸肌麻痹死亡。目前該病發(fā)病不清，缺乏有效的治療方法。多年來人們花費了大量的精力、物力，試圖發(fā)現(xiàn)有效的治療藥物。但是，多數(shù)情況下，許多藥物在動物模型有效，在臨床實驗收不到相同的效果［1，2］，這可能與動物實驗多是選擇在發(fā)病前給藥，而臨床實驗階段都是對臨床確診的患者進(jìn)行藥物干預(yù)有關(guān)。

丁苯酞(dl-3-n-Butylphthalide)是芹菜種子的提取物。在2002年，首次被中國國家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)應(yīng)用于卒中患者［3］。實驗證明，它的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制是多方面的，包括增加缺血區(qū)腦血流量和重構(gòu)缺血區(qū)腦微循環(huán)［4，5］、減少氧化應(yīng)激損傷和改善線粒體的功能［3］、抑制炎癥反應(yīng)［6］和抗細(xì)胞凋亡［7］等。因此，本試驗觀察了丁苯酞在發(fā)病前后給藥對SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因鼠的影響，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 動物模型的建立 B6SJL-Tg(SOD1G93A)1Gur/J半合子雄鼠(購自于美Jackson實驗室)與B6SJLF1雌鼠1:1雜交，子代小鼠于30d時剪尾組織1mm獲取DNA，經(jīng)PCR方法鑒定出SOD1-G93A陽性的小鼠。在恒溫(22～27℃)、恒濕(40% ～50%)、12h光照/黑暗交替循環(huán)、無特殊病原菌的(Specific pathogen free，SPF)環(huán)境中，喂以滅菌的SPF級顆粒型鼠類飼料及滅菌水。

1．2 實驗分組 將40只雄性SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因鼠隨機(jī)分為4組(n=10，雄性)，(1)發(fā)病前用藥組組:在42d給丁苯酞(180mg/kg);(2)發(fā)病前安慰劑組:42d給玉米油;(3)發(fā)病后給藥組，根據(jù)Vercelli A評分為4分(大約為小鼠出生后90d)判斷為發(fā)病時間給丁苯酞(180mg/kg);(4)發(fā)病后安慰劑組，90d給玉米油。

1．3 藥物干預(yù) 丁苯酞(純度＞98%)由石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司提供，將丁苯酞以18mg/ml的濃度溶于玉米油中，安慰劑組給玉米油10ml/kg/d灌胃。

1．4 發(fā)病時間和生存期的觀察 從83d開始，每天進(jìn)行Vercelli A評分［8］，5分:無運動功能障礙;4分:將小鼠懸吊時出現(xiàn)后肢伸展異常或震顫;3分:明顯的后肢無力、步態(tài)異常;2分:雙后肢完全癱瘓，爬行僅靠前肢;1分:雙后肢完全癱瘓，并且將小鼠仰臥后20s內(nèi)小鼠不能翻轉(zhuǎn)。4分為發(fā)病時間，1分為死亡時間。

1．5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13．0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計處理。各組數(shù)據(jù)用±s表示。Kaplane-Meier(K-M)生存分析用于發(fā)病時間和生存時間的統(tǒng)計分析，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 模型的建立

SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因鼠的鑒定 子代鼠尾尖提取的DNA 經(jīng) PCR 擴(kuò)增后，電泳后結(jié)果示:第 1、2、5、6、8、10泳道條帶較亮且寬的為SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因陽性小鼠。相反，第 3、4、7、9 泳道條帶相對模糊且細(xì)窄為SOD1G93A轉(zhuǎn)基因陰性小鼠(見圖1)。

2．2 發(fā)病前應(yīng)用丁苯酞對SOD1G93A轉(zhuǎn)基因鼠的影響 發(fā)病前用藥組的發(fā)病時間為108．3±3．3d，安慰劑組為98．1 ±3．2d。兩者相比，P=0．034，有統(tǒng)計學(xué)意義。發(fā)病前用藥組的生存期為138．0±2．9d，安慰劑組為119．9 ±2．8d，兩者相比P＜0．001，有統(tǒng)計學(xué)差異。通過K-M發(fā)病和生存分析曲線可以動態(tài)的描述各組SOD1G93A轉(zhuǎn)基因鼠的發(fā)病和死亡情況(見圖2)。

2．3 發(fā)病后應(yīng)用丁苯酞對SOD1G93A轉(zhuǎn)基因鼠的影響 通過Vercelli A評分發(fā)現(xiàn)SOD1G93A轉(zhuǎn)基因鼠約90d時，評分達(dá)4分。因此，將90d確定為發(fā)病時間。發(fā)病后給藥組的生存期為134．5±2．4d，安慰劑組為126．1 ±2．8d，兩者相比 P=0．046，有統(tǒng)計學(xué)意義。發(fā)病后與發(fā)病前用藥組的生存期相比，P=0．289，無統(tǒng)計學(xué)差異。通過K-M生存分析曲線可以動態(tài)的描述各組SOD1G93A轉(zhuǎn)基因鼠的死亡情況(見圖3)。

3 討論

ALS是一種致命性神經(jīng)退行性疾病。目前病因不清，可能的發(fā)病機(jī)制有谷氨酸興奮性毒性作用［9］、氧化應(yīng)激［10］、線粒體功能受損［11］、凋亡［12］、異常的蛋白質(zhì)聚集［13］、遺傳基因［14］和環(huán)境因素［15］等。盡管有眾多有關(guān)治療ALS的臨床試驗研究，利魯唑仍是目前惟一FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于治療ALS的藥物［16］，然而其療效甚微，平均延長ALS患者壽命僅3個月的時間。因此目前找出一種安全有效治療ALS的藥物極為重要。目前SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因鼠被廣泛應(yīng)用于有關(guān)ALS治療的臨床前研究。然而，許多在動物模型有效的藥物卻無法在臨床實驗收到相同的效果，原因可能是臨床前試驗設(shè)計不夠合理、藥物干預(yù)時間和療效的判定標(biāo)準(zhǔn)不同所致。有許多關(guān)于SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因鼠的藥物試驗選擇在發(fā)病前給藥。然而，絕大多數(shù)的臨床試驗都是在患者發(fā)病后進(jìn)行藥物干預(yù)，在臨床方面不可能預(yù)防用藥來防止ALS的發(fā)病。因此，在動物試驗時選取多個時間點進(jìn)行藥物干預(yù)可以為以后的臨床試驗提供重要的依據(jù)。

圖1 PCR鑒定結(jié)果

圖2 發(fā)病前應(yīng)用丁苯酞對SOD1G93A轉(zhuǎn)基因鼠的影響

圖3 發(fā)病后應(yīng)用丁苯酞對SOD1G93A轉(zhuǎn)基因鼠的影響

研究證實，丁苯酞在多種神經(jīng)退行性疾病模型如阿爾茨海默病［17］和帕金森病［18］都顯示出很好的神經(jīng)保護(hù)作用。最近Feng等［19］觀察了丁苯酞在發(fā)病后給藥對雌性SOD1G93A轉(zhuǎn)基因鼠的影響，該實驗選取30mg/kg和60mg/kg作為治療劑量，結(jié)果顯示，60mg/kg的丁苯酞具有延長SOD1G93A轉(zhuǎn)基因鼠生存期和改善其運動功能的作用。曾經(jīng)的研究報道顯示，丁苯酞的有效劑量范圍是40～200mg/kg［20］，因此我們最近也進(jìn)行了一項丁苯酞在發(fā)病前給藥對SOD1G93A轉(zhuǎn)基因鼠的劑量相關(guān)性研究，我們選取3個治療劑量分別為60mg/kg、120mg/kg和180mg/kg，結(jié)果顯示3個治療劑量均可以推遲SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因鼠的發(fā)病時間，然而僅180mg/kg治療組具有延長轉(zhuǎn)基因鼠生存期和改善運動功能的作用，該實驗的結(jié)論是180mg/kg的丁苯酞是治療SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因鼠的最佳劑量(尚未發(fā)表的數(shù)據(jù))。然而，該實驗選擇在發(fā)病前給藥(42d)，并且沒有排除性別因素的干擾，以前的研究證由于雌激素具有神經(jīng)保護(hù)作用［21］，造成雌性SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因鼠的生存期明顯長于雄性。因此，本研究排除了性別因素的影響，從而探討丁苯酞在不同的給藥時間下對SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因鼠的影響。

研究結(jié)果顯示，發(fā)病前給藥組的發(fā)病時間被推遲了10d左右，生存期被延長了18d左右，這說明丁苯酞在發(fā)病前給藥具有推遲SOD1G93A轉(zhuǎn)基因鼠的發(fā)病時間和延長其生存期的作用。此外，發(fā)病后給藥組的生存期被延長了8d左右，這說明丁苯酞在發(fā)病后給藥仍具有延長SOD1G93A轉(zhuǎn)基因鼠生存期的作用。同時我們還比較了發(fā)病前后用藥組的生存期，結(jié)果顯示兩者無統(tǒng)計學(xué)差異，這說明無論丁苯酞在發(fā)病前或發(fā)病后給藥對SOD1G93A轉(zhuǎn)基因鼠生存期的延長作用是一樣的。綜上所述，說明丁苯酞對發(fā)病前后SOD1G93A轉(zhuǎn)基因鼠的生存期均有延長作用，支持丁苯酞進(jìn)一步向臨床試驗推廣。

［1］Di Bernardo AB，Cudkowicz ME．Translating preclinicalinsights into effective human trials in ALS［J］．Biochim Biophys Acta，2006，1762:1139－1149．

［2］Benatar M．What zebras and mice can teach us about familial ALS［J］．Neuromuscul Disord，2007，17:671 －672．

［3］Dong GX，F(xiàn)eng YP．Effects of NBP on ATPase and anti-oxidant enzymes activities and lipid peroxidation in transient focal cerebral ischemic rats［J］．Zhongguo Yi Xue Ke Xue Yuan Xue Bao，2002，24:93 －97．

［4］Peng Y，Zeng X，F(xiàn)eng Y，et al．Antiplatelet and antithrombotic activity of L-3-n-butylphthalide in rats［J］．J Cardiovasc Pharmacol，2004，43:876 －881．

［5］Peng Y，Xu SF，Wang L，et al．Effect of-L-3-nbutylphthalideon cerebral infarct volume in the transient cerebral ischemia rats［J］．Chin New Drug，2005，14:420 －423．

［6］Xu H，F(xiàn)eng YP．Effects of d-3-n-butylphthalide(NBP)on pial arterioles in focal cerebral ischemia rats．Inhibitory effects of chiral 3-n-butylphthalide on inflammation following focal ischemic brain injury in rats［J］．Acta Pharmacol Sin，2000，21:433 －438．

［7］Chang Q，Wang XL．Effects of chiral 3-n-butylphthalide on apoptosis induced by transient focal cerebral ischemia in rats［J］．Acta Pharmacol Sin，2003，24:796 －804．

［8］Vercelli A，Mereuta OM，Garbossa D，et al．Human mesenchymal stem cell transplantation extends survival，improves motor performance and decreases neuroinflammation in mouse model of amyotrophic lateral sclerosis［J］．Neurobiol Dis，2008，31:395 －405．

［9］Wicklund MP．Amyotrophic lateral sclerosis:possible role of environmental influences［J］．Neurol Clin，2005，23:461 －484．

［10］Beckman JS，Estevez AG，Crow JP，et al．Superoxide dismutase and the death of motoneurons in ALS［J］．Trends Neurosci，2001，24:15 －20．

［11］Xu JX．Radical metabolism is partner to energy metabolism in mitochondria［J］．Ann N Y Acad Sci，2004，1011:57 －60．

［12］Przedborski S．Programmed cell death in amyotrophic lateral sclerosis:a mechanism of pathogenic and therapeutic importance［J］．Neurologist，2004，10:1 －7．

［13］Wood JD，Beaujeux TP，Shaw PJ．Protein aggregation in motor neurone disorders［J］．Neuropathol Appl Neurobiol，2003，29:529 －545．

［14］Simpson CL，Al-Chalabi A．Amyotrophic lateral sclerosis as a complex genetic disease［J］．Biochim Biophys Acta，2006，1762:973 －985．

［15］Wicklund MP．Amyotrophic lateral sclerosis:possible role of environmental influences［J］．Neurol Clin，2005，23:461 －484．

［16］Bensimon G，Lacomblez L，Meininger V．A controlled trial of riluzole in amyotrophic lateral sclerosis［J］．ALS/Riluzole Study Group［J］．N Engl J Med，1994，330:585 －591．

［17］Peng Y，Sun J，Hon S，et al．L-3-n-butylphthalide improves cognitive impairment and reduces amyloid-beta in a transgenic model of Alzheimer’s disease［J］．J Neurosci，2010，30:8180 －8189．

［18］Huang JZ，Chen YZ，Su M，et al．dl-3-n-Butylphthalide prevents oxidative damage and reduces mitochondrial dysfunction in an MPP(+)-induced cellular model of Parkinson’s disease［J］．Neurosci Lett，2010，475:89－94．

［19］Feng X，Peng Y，Liu M，et al．DL-3-n-butylphthalide extends survival by attenuating glial activation in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis［J］．Neuropharmacology，2012，62(2):1004 －1010．

［20］Chong Z，F(xiàn)eng Y．dl-3-n-butylphthalide reduces brain damage in mice with closed head injury［J］．Chin Med J(Engl)，2000，113(7):613 －616．

［21］Choi CI，Lee YD，Gwag BJ，et al．Effects of estrogen on lifespan and motor functions in female hSOD1 G93A transgenic mice［J］．J Neurol Sci，2008，268(1 －2):40 －47．