維甲酸致神經管發育缺陷中相關基因的功能分類

李新軍， 韓楊云， 徐 宏， 楊 忠， 曾 義， 孫中書， 李紅麗， 龍曉東， 游 潮

神經管缺陷(neural tube defects，NTD)作為神經管異常發育的一個病理學結果，神經管形成時期極容易受到多種內、外因素的干擾，眾多遺傳或環境因素的改變均可導致中樞神經系統先天畸形，但迄今對涉及此過程的基因表達與調控的研究較少［1］。基因芯片能同時監控組織細胞成千上萬基因的表達，為在分子水平研究復雜的病理生理過程或信號通路提供了最有力的工具［2］。實驗應用含有1100余個已知基因的中密度芯片比較了胚胎9．5d、10．5d正常與同期NTD小鼠神經管組織的基因表達差異，并對差異表達基因進行功能分類。以求發現與NTD發生和神經胚的關鍵基因，并探討它們可能的分子調控途徑。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 實驗動物 清潔級成年昆明種小鼠120只，55～65日齡，體質量22～28g，無特異病原體，雌雄各半，由第三軍醫大學實驗動物中心提供，實驗動物許可證號:SCXK(渝)2007003。

1．1．2 儀器 硅化玻片、雜交密封艙購自美國TeleChem公司;Microcon YM－30為 Millipore產品。ScanArray4000芯片掃描儀為美國General Scanning公司產品。雜交爐購自美國Robbins Scientific公司。

1．1．3 主要試劑 TRIZOL試劑(RNA提取液)購自 Gibco－BRL公司;維甲酸(RA)購自美國Sigma公司;基因微點陣購自香港Amersham Pharmacia公司;基因序列購自美國Incyte公司小鼠基因文庫。

1．2 方法

1．2．1 實驗動物分組與造模 60對成年昆明種小鼠，于18:00按雌雄1∶1合籠，次日8:00取出，檢查雌鼠陰道口有無陰栓。將發現陰栓者的當日早晨8:00定為孕期第0天(E0d)，16:00定為E0．5d。60只孕鼠被隨機分成RA組(n=30)和正常對照組(n=30)。根據Klootwijk等［3］的方法制備NTD模型。將RA溶于玉米油內(40g/L)，按50mg/kg于孕期E7．0d～7．25d時一次性喂服孕鼠，制備NTD模型。同時正常對照組喂服等量玉米油。

1．2．2 標本采集及大體形態觀察 在E9．5(n=16)、E10．5(n=12)時，處死正常及 NTD 孕鼠，剖腹取胎，在4倍解剖顯微鏡下確定已造成NTD發生，并分離胎盤、胎膜組織后，對鼠胚進行形態學辨別篩選，檢查活胎數、死胎數以及每個胚胎頭部、面部、脊柱、尾部等發育的外觀特征，獲得各階段腦泡及脊神經組織，挑選典型的異常神經管組織進行總RNA的分離和提取。

1．2．3 總RNA的提取與檢測 用TRIZOL試劑提取總RNA，分光光度儀檢測RNA樣本濃度，最后按約 3．3μg/μl的濃度進行稀釋分裝，15μl/管(50μg)，－80℃保存。每組取總 RNA 20μg，1% 瓊脂糖膠電泳驗證其純度。

1．2．4 基因芯片雜交與掃描分析 取50μg總RNA，反轉錄合成 cDNA，分別用 2μl Cy3－dUTP(正常對照組)或Cy5－dUTP(RA組)標記cDNA。參照蔣立堅等［4］的方法，用含有1100余個已知基因的中密度芯片對每組標記的cDNA雜交。雜交后芯片用ScanAry 4000掃描儀掃描獲取微陣列圖像，掃描圖像經斯坦福大學ScanAlyze2．51軟件分析。反復試驗3次。

1．2．5 基因表達差異的評價標準 (1)當2組組織中基因表達的強度比值(Cy5/Cy3)大于2．0或小于0．5時，即認為它們存在差異表達，小于0．5者為RA處理后下調基因，大于2．0者為上調基因。(2)3次重復實驗中均出現相同趨勢變化。(3)3次實驗中有2次出現相同趨勢改變且第3次結果不矛盾。

2 結果

2．1 實驗動物數量分析 實驗納入60對成年昆明種小鼠，將受孕的60只雌鼠隨機分成RA組和正常對照組，每組30只。喂服RA組有2只孕鼠死亡，正常對照組對應淘汰2只孕鼠，共56只孕鼠納入了結果分析(見表1)。

表1 RA致NTD鼠胚發生率(n/%)

2．2 正常及RA作用下鼠胚的形態學觀察實驗于E9．5，E10．5d處死正常及NTD孕鼠，剖腹取胎，發現正常與經RA處理的孕鼠的胚胎數多在8～16個。解剖顯微鏡下觀察正常E9．5，E10．5d鼠胚腦部閉合完全，外觀飽滿圓滑，腮弓清晰，眼泡、耳泡可見，脊柱表面完整無裂口;尾部細長彎曲，前后肢芽出現。而RA組鼠胚死胎明顯增多，形態多樣;典型的形態畸形包括顱腦頂部未閉呈現裂口、后腦及面部異常、脊柱或尾部有裂口及無尾或短尾等

2．3 E9．5d、E10．5 正常與同期神經管組織的差異表達基因功能分類 E9．5d－E10．5d組DNA芯片掃描圖像(見圖1～圖3)經計算機軟件分析，通過比較正常E9．5d與E10．5d獲得138個差異表達基因，其中上調基因71個，下調基因67個。根據基因功能分類主要包含了細胞周期和凋亡相關基因(32條)，信號轉導基因(26條)，轉錄與翻譯調控(13條)，蛋白合成與調控(11條)，基質與骨架蛋白(14條)等幾大類(見表2)。通過比較正常E9．5d與同期RA誘導所致NTD神經管組織的基因表達，獲得了20個差異表達基因;按功能分類包括細胞周期與凋亡相關基因9條，信號轉導4條，轉錄與翻譯2條，能量與代謝基因5條(見表3)。E10．5d與同期RA作用后神經管組織的表達差異基因有29個;其中細胞周期與凋亡相關基因8條，信號轉導基因4條，轉錄與翻譯調控4條，能量與代謝基因4條，熱休克基因3條，基質與骨架蛋白3條，其它3條(見表4)。

圖1 正常9．5d與10．5d鼠胚神經組織的基因表達差異

表2 E9．5d－E10．5d組神經管組織的差異表達基因功能分類

圖2 9．5d正常與RA處理神經管組織的基因表達差異

圖3 10．5d正常與RA處理神經管組織的基因表達差異

3 討論

神經管缺陷(neural tube defects，NTD)，是由于在胚胎發育過程中，神經管閉合不全引起的一組缺陷。主要包括無腦畸形、腦膨出、腦脊膨出和和脊柱裂等，是造成孕婦流產、圍產兒和嬰兒死亡或終身殘疾的主要原因之一。我國是已知世界神經管缺陷的高發國，神經管缺陷在所有出生缺陷中居首位。

RA決定胚胎頭尾軸的形成，在胚胎的發育過程中是一個重要形成因素。喂服RA的劑量不同，畸形的程度和部位也會有差異［5，6］。因此，實驗統一采用按RA(50mg/kg)喂服孕期E7．0～7．25d的孕鼠，制備NTD模型。減少了由于RA喂服量的不同導致的不同程度的畸形和不同部位的畸形的差異。通過這種方法建立的NTD模型可靠，已為廣大學者接受認可。實驗觀察到許多畸形胚胎包括顱腦頂部未閉、后腦和面部的異常、脊柱或尾部未閉及無尾或短尾等。這些畸形與類似研究描述相一致［7，8］。實驗納入60對成年昆明種小鼠，喂服RA組有2只孕鼠因未進食、飲水及走動等原因死亡，正常對照組對應淘汰2只孕鼠，共56只孕鼠納入了結果分析。制模成功率為93．33%，我們認為制模成功的關鍵在于喂服RA劑量及時間的嚴格控制。

表3 正常E9．5d與同期RA處理組神經管組織的差異表達基因功能分類

表4 正常E10．5d與RA處理組神經管組織的差異表達基因功能分類

實驗應用含有1100余個已知基因的中密度芯片，通過比較正常E9．5d與E10．5d獲得138個差異表達基因，其中上調基因71個，下調基因67個。根據基因功能分類主要包含了細胞周期和凋亡相關基因(32條)，信號轉導基因(26條)，轉錄與翻譯調控(13條)，蛋白合成與調控(11條)，基質與骨架蛋白(14條)等幾大類。通過比較正常E9．5d與同期RA誘導所致NTD神經管組織的基因表達，獲得了20個差異表達基因;按功能分類包括細胞周期與凋亡相關基因9條，信號轉導4條，轉錄與翻譯2條，能量與代謝基因5條。E10．5d與同期RA作用后神經管組織的表達差異基因有29個;其中細胞周期與凋亡相關基因8條，信號轉導基因4條，轉錄與翻譯調控4條，能量與代謝基因4條，熱休克基因3條，基質與骨架蛋白3條，其它3條。結果提示包括細胞周期與凋亡相關基因、信號轉導基因、轉錄與翻譯調控、能量與代謝基因、熱休克基因、基質與骨架蛋白等多種基因參與了 NTD的發生過程。其中 NeK7、IGFBP5、ZW10、Csf3r、PSMC6、Rb1 在 RA 處理致 NTD組均呈現下調;apoa－4在RA處理致NTD組均呈現上調，差異基因在時空限制性的差異表達顯示這些基因與正常神經管的發生和RA誘導所致NTD密切相關。

另外實驗發現在眾多種類的差異表達基因中，細胞周期與凋亡相關基因所占比例最大，分別占正常 E9．5d－E10．5d 組差異基因的 23．2%(32/138)，E9．5dNTD 組 45%(9/20)及 E10．5dNTD 組 27．6%(8/29)。提示細胞周期與凋亡相關基因可能在正常神經管的發生和RA誘導所致NTD的過程中發揮重要作用。發育神經生物學的研究認為神經管形成過程中準確有序的細胞周期調控和細胞凋亡是保證神經管正常發生的兩個重要因素，細胞周期中真核細胞分裂必須通過兩個重要的限制點:即通過G1－S期的轉換進入DNA合成;G2－M期轉換進入有絲分裂。細胞周期素(cyclin)與細胞素依賴性蛋白激酶(CDKs)［9］復合物有序的形成，活化與失活是驅使細胞周期正常循環進行的內在動力同時在細胞周期的4個時相(G1，S，G2，M)，各種內外環境因素即通過影響相關分子而參與對細胞周期的調控。分析正常神經管形成前后及RA誘導產生NTD后的差異表達基因，可以發現相當部分差異表達基因與細胞周期和凋亡相關。多種G1期的正向調節因子在神經管形成前后表達顯著下調，包括 CCND2，CCNE1，CCNH，Rb1，CDK4及cdc25a等，而兩種重要的細胞增殖抑制因子p18(CDK4抑制因子)，p57/kip2等表達顯著升高，表明伴隨神經管的形成，神經上皮阻滯于G1期的細胞顯著增多，增殖能力下降。此外，本實驗結果也顯示與G2－M期轉換的細胞周期調節子CDC5L，cdc25A，cyclinA等的表達也有下調，提示在神經管形成后可能也伴隨了G2－M期轉換過程的減弱。在RA誘導致 NTD(包括 E9．5D與E10．5D兩個時相)出現的差異表達基因中，細胞周期相關基因也是為數最多的一類，其中 Rb1，Ccnd2，Nek7及ZW10下調提示存在G1期的阻滯。但與正常神經管形成過程中基因表達變化不同的是一些細胞周期相關基因包括p57kip2，CDK5等在RA作用后呈現下調趨勢(在正常神經管形成后呈上調)。P57kip2是多種G1期調解子的重要抑制劑，當它與cyclinECDK2，cyclinD2－CDK4 及 cyclinA－CDK2 等結合后，作為細胞增殖的負向調節因子抑制細胞周期進程，是維持機體非增殖狀態的關鍵因子之一［10］。P57kip2的表達改變與細胞凋亡發生密切關聯［11］。但P57kip2在神經系統發育中的作用尚不十分清楚。CDK5雖然作為細胞周期家族的成員之一，目前對于其在細胞分裂中的作用尚不明確。相反，關于它參與分裂后神經細胞功能調節等的研究較多，觀察發現敲除CDK基因的小鼠有明顯的神經系統發于障礙，甚至出現胚胎期致使的嚴重缺陷［12］，提示CDK5是CNS發育必要的關鍵基因之一。近年來多數研究提示CDK5主要參與了分裂后神經細胞的遷移，軸突生長與導向等作用，在神經系統的發于成熟過程中扮演了重要作用［13，14］，其表達隨著細胞逃逸出細胞周期而逐漸升高。CDK5參與對多種信號傳導通路上靶蛋白的磷酸化作用。本實驗觀察到NTD發生時CDK5的表達呈下調趨勢，提示在RA作用后可能改變了CDK5對神經上皮的作用。

實驗同時發現脂質代謝相關的一些基因差異表達，如 Fasn，Cpt1a，Nr2f2 和 Apoa－4。其中 FASN 在RA作用下呈現下調，而 Cptla，NR2F2，和載脂蛋白A4在RA作用下表達上調，提示脂類代謝異常可能是 NTD 的發生一個重要因素［15～22］。IGFBP5 作為IGF結合蛋白家族的一員，其作用與IGF密切相關，在腦發育中IGFBP5有較高表達，并參與小腦皮質的發育和海馬形成等［23，24］。實驗發現 IGFBP5在 RA組表達下調，進一步證實該基因在神經系統發育中有特殊作用。

總之，實驗通過基因芯片技術篩選出部分正常胚胎同NTD小鼠神經管組織的差異基因，根據相關基因已報道的功能，提示包括包括細胞周期家族等多種基因參與了NTD的發生過程;結果同時也為研究正常神經胚形成的分子機制提供了有益線索。

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