可卡因－苯丙胺調節轉錄肽對小鼠缺血/再灌注的保護作用及腦組織8－OHdG和3－NT含量變化的研究

王路娜， 沙杜鵑， 韓 勇， 顧雙雙， 李啟明， 李 瑾， 張 均

腦卒中是一種發病率、致殘率及復發率很高的常見神經系統疾病，其中約87%是缺血性卒中［1］。缺血性卒中神經元的損害存在復雜的病理機制，氧化應激是其中的重要病理機制之一［2］，也是缺血性腦卒中后誘導神經元凋亡的重要觸發因素。

可卡因-苯丙胺調節轉錄肽(cocaine-and amphetamine-regulated transcript，CART)是一種由神經中樞和神經內分泌組織表達的神經肽。CART在腦組織中有廣泛的表達，具有許多重要的生理功能，包括參與攝食行為、能量調節、抑制藥物成癮及戒除、抗焦慮、神經內分泌調節、應激反應、神經營養等功能［3］。近年來，通過建立缺糖缺氧體外、缺血體內模型進行的多項研究發現，CART55-102在大鼠體內灶性缺血的大腦皮質和體外培養的缺氧缺糖(OGD)皮質神經元中有表達［4］;能使大腦中動脈閉塞所致的腦梗死體積縮小，體外培養的大腦皮質神經元加入CART肽鏈能減少OGD誘導的神經元死亡。CART肽對缺血神經元的保護作用是肯定的，但其確切的作用機制尚不清楚。研究發現，褪黑素，一種與CART相似的調節肽，能降低細胞內活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)水平，保護神經細胞［5］。本研究擬通過建立腦缺血小鼠模型，探討CART對腦缺血后腦組織蛋白質和核酸的過氧化產物水平的影響。

1 材料與方法

1．1 材料

實驗動物:選用健康雄性昆明白小鼠，體重18～22g，10～12周齡，由南京市鼓樓醫院動物實驗中心提供;所有小鼠飼養條件(室溫、食水、光照)相同。228只小鼠隨機分組:腦缺血組(n=60)，CART組(n=60)，生理鹽水(NS)對照組(n=60)，假手術組(n=48)。CART組于腦缺血 2h即刻給予CART55-102［(0．5μg)，Phoenix pharmaceuticals 公司］尾靜脈注射，每24h重復給藥一次;生理鹽水對照組在相同時間點、相同方法給予等體積的NS。

1．2 方法及觀察指標

1．2．1 模型的制備 采用大腦中動脈閉塞(Middle Cerebral Artery Occlusion，MCAO) 模型［6］。1%戊巴比妥鈉(美國Sigma公司)腹腔注射麻醉小鼠(45mg/kg)，于頸部略偏右側作縱行切口，暴露并游離右側頸總動脈、頸內動脈、頸外動脈和迷走神經等，用8-0絲線在頸總動脈近心端結扎，而在遠心端預留活結。用微動脈夾于活結遠側暫時夾閉頸總動脈，在動脈夾與結扎處之間用顯微剪剪一小口，插入尼龍線栓(北京沙東生物技術有限公司，線身直徑0．14mm，線頭直徑0．18 ±0．01mm，線長 25mm)，隨之稍扎緊預留的活結，松開頸內動脈上的血管夾，將線栓向頸內動脈方向推送，直到遇到輕微阻力不能再前進為止。此時線栓進入大腦中動脈起始部，進線深度約為10mm。然后將活結扎緊，縫合皮。缺血2h再次麻醉小鼠，抽出栓塞線段至頸外動脈處，遇到阻力即停止。扎緊絲線，剪斷血管外多余的絲線，實現再灌注。術中及術畢2h內用60w白熾燈垂直距離50cm照射小鼠，使其肛溫保持37±0．5℃。于模型制作成功12h，24h，48h，72h處死小鼠，斷頭取腦，留取標本－70℃凍存。

在缺血2h對小鼠進行神經功能缺損評分(采用Longa 5分法)［7］:0分，無神經缺損癥狀;1分，左前肢不能完全伸直;2分，向左旋轉;3分，行走向左側傾倒;4分，不能自發行走，意識喪失。MCAO后2h，再灌注前對小鼠神經功能進行評分，評分在2～3分者定位造模成功。

1．2．2 腦梗死體積計算［4］小鼠按既定時間點處死后，快速取出腦組織，放入－70℃冰箱中冷凍10～15min，自額極向后冠狀面切成2mm厚的切片，放入1%TTC溶液(美國Sigma公司)中，嚴格避光，37℃水浴箱中孵育30min(每5min翻動一下腦片);用PBS液(博士德公司)沖洗腦組織2次后移置4%多聚甲醛(上海凌風化學試劑有限公司)中固定，置于4℃固定保存。白色部分為梗死組織，紅色部分為正常組織。用500萬像素照相機攝片后圖像經過Image Pro Plus6．0數碼圖像分析系統軟件處理，計算梗死的總體積。計算公式:腦梗死體積(%)=［LT－(RT－RI)］/LT×100%(LT:左側大腦半球面積;RT:右側大腦半球面積;RI:梗死部分面積)。

1．2．3 8-OHdG和3-NT檢測 斷頭取腦，梗死組織置于EP管內，分別加入1mlPBS液(pH 7．4)充分勻漿;3000r/min離心20min，收集上清液。采用雙抗體夾心法［酶聯免疫吸附試驗(enzyme-1inked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒均購自上海杰美基因醫藥科技有限公司］，在小鼠8-OHdG抗體和3-NT抗體包被的微孔板中分別依次加入含8-OHdG和3-NT的標準品和樣品，與辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記的8-OHdG抗體和3-NT抗體結合形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，徹底洗滌后甲基聯苯胺(tetramethylbenzidine，TMB)顯色，用酶標儀在450nm波長下測量各孔吸光度(A)。結果以標準品濃度為橫坐標、A為縱坐標繪制標準曲線。根據樣品A由標準曲線查得相應濃度，再乘以稀釋倍數即為樣品的實際濃度。

1．3 統計學處理 采用SPSS13．0統計軟件行統計學處理，數據用±s表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK法，P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 腦梗死體積 CART組不同時間點腦梗死體積均不同程度縮小，以腦缺血48h最為顯著;與腦缺血組、生理鹽水對照組比較，腦缺血24h、48h和72h其差異均有統計學意義(P＜0．05)(見表1)。

2．2 8 -OHdG含量 腦缺血組不同時間點小鼠腦組織8-OHdG含量均高于假手術組，以腦缺血12h為著，后逐漸下降;與假手術組比較，僅腦缺血12h和24h其差異有統計學意義(P＜0．05～0．01);CART組各不同時間點腦內8-OHdG水平均被下調，但與腦缺血組、生理鹽水對照組比較，CART僅在腦缺血12h顯著減低了腦內8-OHdG水平(P＜0．05)(見表2)。

2．3 3 -NT含量 腦缺血組不同時間點小鼠腦組織3-NT水平均高于假手術組，以48h為著，與假手術組比較其差異均有統計學意義(P＜0．01);CART組各時間點3-NT水平均下降，與腦缺血組、生理鹽水對照組比較24h、48h和72h其差異均有統計學意義(P＜0．01)(見表3)。

表1 不同時間點腦梗死體積比較(每組n=3，%)

表2 不同時間點8-OHdG含量的變化(每組n=6，ng/L)

表3 不同時間點3-NT含量的變化(每組n=6，nmol/L)

3 討論

CART肽是一種1995年發現的分泌型神經肽，主要分布于下丘腦、垂體、腎上腺、胰腺及消化道。CART肽在腦組織中表達廣泛，與多種腦功能有關，包括能量代謝、食欲的控制和神經保護。研究表明，用RNA干擾抑制CART表達，小鼠缺血性腦梗死體積及缺氧缺糖后神經元死亡數量均有所上升［8］;雌激素能通過上調CART55-102水平對缺血神經元發揮保護作用［4］，表明CART對缺血局部神經元具有保護作用。我們通過動物實驗研究發現:CART肽可明顯縮小缺血/再灌注小鼠腦梗死體積，與其他的研究結果一致［9］。CART的神經保護機制報道尚少;有體外研究發現，CART通過增強細胞外信號調節激酶(ERK)磷酸化［10］，影響鈣通道活性發揮調節作用;CART還可通過顯著降低胱冬酶-3(caspase-3)活性［9］，減少缺氧缺糖神經元凋亡;但其對缺血神經元的保護作用機制尚不十分明確。

氧化應激在缺血性卒中的各個階段起著不同程度的作用，是缺血性腦卒中組織和細胞損傷的主要原因［11］。氧化應激可引起脂質、蛋白質和核酸的過氧化，8-OHdG和3-NT分別是核酸和蛋白質過氧化的主要產物，也是公認氧化應激檢測指標［12］。我們的研究發現:梗死側各時間點小鼠腦組織3-NT水平均高于假手術組(P＜0．01)，與假手術組比較腦缺血12～24h小鼠腦組織8-OHdG含量顯著被上調(P＜0．05 ～0．01)，與 Chen 等的研究結果一致［13］，進一步證實了氧化應激是腦缺血期間腦損傷主要病理機制之一。氧化應激使細胞膜結構遭到破壞、蛋白降解、核酸主鏈斷裂、透明質酸解聚、細胞崩解、細胞發生不可逆改變，最終導致神經元死亡。CART肽可使腦缺血早期(12h)腦內核酸過氧化產物8-OHdG水平顯著下降(P＜0．05);在腦缺血不同時間點均不同程度地降低小鼠腦缺血后腦內3-NT含量的增高(P＜0．01);提示CART肽對腦缺血小鼠腦組織核酸和蛋白質過氧化具有抑制作用，其中蛋白質過氧化物3-NT下降為顯著。生物體是由大量蛋白質組成的，蛋白質受到ROS攻擊導致其氨基酸鏈羰基化;同時ROS還可使己糖胺途徑、多元醇等通路激活及過氧化硝酸鹽合成增加，而使蛋白質功能失活［14］。研究表明，抑制蛋白質過氧化即可縮小腦梗死體積［15］。CART肽抑制蛋白質和核酸過氧化，從而抑制蛋白質變性，核酸裂變，保護缺血神經元。

本研究結果表明CART肽對腦缺血神經元的保護作用可能與抑制氧化應激密切相關，其抑制氧化應激的確切機制尚有待繼續進一步深入研究。

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