基因芯片技術應用于動物傳染病診斷的研究進展

郝菊秋

（遼寧職業學院，遼寧 鐵嶺 112000）

1996年，美國Affvmetrix生物公司制造出世界上第一塊商業化的基因芯片，由此掀起了基因芯片研究熱潮。基因芯片技術是一項將生命學科與微電子學、化學和計算機科學等集于一體的高度交叉的尖端應用型技術，現已在藥物篩選、藥物開發、基因診斷、基因突變、基因表達分析、多態性分析和環境科學等多個領域顯示出巨大的理論意義和應用價值［1］，基因芯片的誕生，不但為獸醫科學的發展和科學研究提供了有用手段，而且為動物疾病的診斷和防治提供了新的方法。本文就基因芯片應用于動物傳染病診斷的研究進展作一介紹。

1 基因芯片技術概述

基因芯片，又稱DNA芯片（DNA chips），屬于生物芯片中的一種，是綜合微電子學、物理學、化學及生物學等高新技術，把大量DNA探針或基因片段按特定的排列方式固定在硅片、玻璃、塑料或尼龍膜等載體上，形成的致密、有序的DNA分子點陣，因固相載體常用硅玻片或硅芯片，故稱之為基因芯片。基因芯片技術的基本原理是分子生物學中的核酸分子原位雜交技術：將短鏈核酸分子固定在固相載體上作為探針，待分析樣品經過標記后與固定在芯片上的探針雜交。基因芯片技術的分類方法很多［2］，最常用的是按載體上所點探針的長度分為cDNA芯片和寡核苷酸芯片。根據芯片的功能可以分為基因表達譜芯片和DNA測序芯片；根據載體也可分為液相芯片、固相芯片。無論哪種芯片，其技術流程主要包括芯片的制備、待測樣本的制備和標記、雜交反應、結果檢測和數據處理分析等。與傳統的核酸印跡雜交技術相比，基因芯片具有可信度高、信息量大、操作簡單、重復性強以及可以反復利用等諸多優點。

2 基因芯片技術在動物傳染病診斷中的應用

2.1 cDNA診斷芯片 豬傳染病中，多種病原體混合感染極其常見，檢測其病原微生物就顯得尤為重要。張煥容等［3］制備偽狂犬病病毒（PRV）、豬細小病毒（PPV）和流行性乙型腦炎病毒（JEV）檢測基因芯片。選定靶基因最佳點樣質量濃度為200mg／L，用基因芯片點樣儀將其點制在氨基化基片上。結果表明，探針最佳使用質量濃度為3000μg／L，芯片系統檢測靈敏度可達3μg／L。郭瑤等［4］采用連接酶檢測反應（LDR）-PCR和基因芯片技術，檢測和鑒別豬圓環病毒2型（PCV-2）、豬細小病毒（PPV）和偽狂犬病病毒（PRV）在3種病毒的保守區內分別設計一對LDR探針，兩端各連接一段通用序列，依次進行LDR、通用引物熒光標記擴增和芯片雜交，同時比較引物標記和Cy5-dCTP標記方法的靈敏度。利用建立的方法對41例臨床樣品進行檢測，與普通PCR檢測結果符合率為97.6%～100%。表明該方法可以特異地檢測PCV2、PPV和PRV 3種病毒。

cDNA診斷芯片的研制應用于禽和馬的一些常見傳染病中。田麗娜等［5］將克隆和鑒定的AIV的HA、NA、M、NS、NP基因以及 NDV、IBDV、IBV的保守基因片段作為探針，同時以克隆的GAPDH基因作為陽性對照，利用芯片點樣系統SpotArray-TM24將探針與陽性對照、陰性對照和空白對照按照設計好的陣列點在基片上，制備了AIV等RNA病毒診斷芯片，該方法對20份已鑒定的H5N1亞型禽流感病毒的檢出率為100%（20／20）；10份現地送檢的疑似AIV樣品的檢出率為70%（7／10），檢測結果與RT-PCR和雞胚傳代分離鑒定的符合率為100%。結果表明，制備的DNA芯片可有效診斷禽流感病毒。汪琳等［6］采用人工拼接的方式拼接了非洲馬瘟病毒核酸序列、通過分子克隆技術獲得西尼羅熱、馬冠狀病毒、馬鼻肺炎病毒和馬動脈炎病毒的特異基因片段，設計合成5種馬病病毒高度保守的特異性核酸序列作為檢測探針點制于芯片上，再用多重不對稱PCR以拼接、克隆的核酸序列為模板擴增目的片段，與芯片上探針特異結合。本基因芯片檢測方法可應用于大規模出入境馬屬動物的快速篩查。

2.2 寡核苷酸診斷芯片 寡聚核苷酸芯片序列選擇經過優化，利用合成的一定長度的寡核苷酸單鏈探針代替全長cDNA點樣，制成芯片。狂犬病是狂犬病病毒引起的一種急性中樞神經系統人獸共患病。張偉等［7］根據已發表的狂犬病病毒（RV）的序列，設計合成能擴增高度保守核（N）蛋白片段的一對引物。通過生物素標記PCR技術，將核（N）蛋白基因片段作為探針點在硝酸素纖維膜上，制作成疾病診斷基因芯片。取160份可疑動物的血液，提取核酸作模板進行PCR擴增，將其產物與診斷基因芯片進行特異性逆向點雜交檢測；并用蔗糖密度梯度離心和凝膠層析純化狂犬病病毒作抗原，建立檢測RV抗體的間接ELISA。把以上兩種方法應用于臨床，結果基因芯片的檢測率比ELISA方法和（RT）PCR要高15%左右。

姜永厚等［8］建立一種可同時檢測區分豬瘟病毒（CSFV），豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒（PRRSV）和豬圓環病毒2型（PCV-2）的寡核苷酸基因芯片方法，本研究針對每種病毒設計了4條～6條寡核苷酸探針。利用建立的寡核苷酸基因芯片方法對76個仔豬樣本進行了檢測，其中25個樣本（32.9%）同時感染了2種以上病毒。郭煥成等［9］建立高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒Nsp2缺失變異株與經典美洲型毒株基因芯片鑒別方法。設計擴增美洲型PRRSV保守序列和包含基因缺失區域的Nsp2基因片段的二重PCR引物，并設計長度為31～35nt的美洲型毒株通用寡核苷酸探針和非缺失株相對于變異株Nsp2基因缺失區域的探針。建立的寡核苷酸芯片方法能夠準確鑒別高致病性PRRSV Nsp2缺失變異株。楊林等［10］根據豬流感病毒（SIV）的M基因序列設計了1對特異性引物M1／M2，擴增出大小為229bp的目的片段。針對這個基因片段，再設計合成4條寡核苷酸探針，其中反向引物的5′端用熒光素Cy3標記。以熒光標記不對稱PCR技術為基礎，通過將單鏈PCR產物與芯片雜交實現對SIV的檢測。利用該方法對39份豬組織樣品進行檢測，本方法具有良好的特異性和敏感性。

韓雪清等［11］根據GenBank上已發表的禽流感病毒不同亞型的基因序列，設計合成了25對特異性引物和1對通用引物，然后以各亞型病毒的參考株RNA作為模板，建立擴增不同亞型的多重RTPCR方法。參考各亞型病毒靶cDNAs區域的保守序列設計了52條亞型特異的探針。在此基礎上，將設計好的探針點制到處理好的玻片上，制備了禽流感病毒分型鑒定基因芯片，結合所建立的擴增不同亞型的多重RT-PCR方法，開發了禽流感病毒亞型鑒定基因芯片試劑。利用收集自49個地區的2653份標本對其特異性和敏感性進行了初步評價。證明該病毒分型基因芯片具有良好的特異性、敏感性。

3 結論及展望

基因芯片技術在諸多領域已呈現出廣闊的應用前景和商業前景，已引起世界各國的廣泛關注。目前，基因芯片技術在醫學、分子生物學領域應用越來越廣泛，受到人們的普遍重視；隨著芯片技術的不斷研究和應用，很多問題正在逐步解決，人醫已有10余個應用芯片技術開發的檢測試劑盒被政府批準使用。隨著基因芯片技術不斷發展完善，基因芯片將會成為一種更快速、準確和簡便的動物傳染病檢測技術。在不久的將來，基因芯片技術將為動物傳染病的診斷提供一個重要的研究和應用平臺。

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［2］陳堅，劉業兵，寧宜寶.基因芯片技術及其在動物微生物研究中的應用［J］.中國獸藥雜志，2010，44（12）：46-49.

［3］張煥容，曹三杰，文心田，等.偽狂犬病病毒、豬細小病毒和流行性乙型腦炎病毒檢測基因芯片的制備［J］.中國獸醫學報，2007，27（5）：667-670.

［4］郭 瑤，汪 平，董沁芳，等.同時檢測豬圓環病毒2型、豬細小病毒和偽狂犬病病毒連接酶檢測反應-PCR基因芯片檢測方法的建立［J］.中國預防獸醫學報，2011，33（7），526-530.

［5］田麗娜，王秀榮，楊忠蘋，等.禽流感病毒等RNA病毒鑒別基因芯片的制備［J］.中國獸醫科學，2008，38（08）：685-690.

［6］汪琳，周琦，柏亞鐸，等.五種馬病毒基因芯片檢測方法的建立［J］.檢驗檢疫學刊，2011，21（3）：38-41.

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［8］姜永厚，商晗武，徐 輝，等.基于多重PCR的寡核苷酸基因芯片檢測豬瘟病毒，豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒及豬圓環病毒1型和2型［J］.中國預防獸醫學報，2010，32（3）：194-199.

［9］郭煥成，席進，李江南，等.高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒Nsp2缺失變異株與經典美洲型毒株基因芯片鑒別方法的建立［J］.中國生物制品學雜志，2010，32（11）：1254-1259.

［10］楊 林，馬世春，蘇增華，等.豬流感病毒基因芯片檢測技術的研究［J］.中國獸醫雜志，2008，44（7）：3-5.

［11］韓雪清，林祥梅，侯義宏，等.禽流感病毒分型基因芯片的研制［J］.微生物學報，2008，48（9）：1241-1249.