ERK信號傳導調節腦缺血再灌注中腦源性神經營養因子介導的神經保護作用

嚴之紅 郭威早 佟 倩

(航天中心醫院高干二科，北京 100049)

缺血再灌注(IR)損傷是腦血管疾病組織損害中核心病理因素之一〔1〕。研究顯示，細胞外調節激酶(ERK)信號通路在IR損傷的修復機制中具有重要作用〔2〕，而腦源性神經營養因子(BDNF)對神經損傷的保護作用亦獲得了明確的實驗依據，并且這種保護作用的分子機制與ERK信號通路關系密切〔3〕。然而，BDNF和ERK信號通路在IR損傷中的關系目前尚不明確。本文旨在研究BDNF在IR損傷中的神經保護作用及其與ERK信號傳導的關系。

1 材料與方法

1.1 IR損傷動物模型 體重250 g左右的健康雄性SD大鼠被隨機分為A、B、C三組，每組6只，所有的大鼠均經歷腦局灶性缺血再灌注過程。MCAO缺血再灌注參考文獻〔4〕報道并作適度改良，具體操作方法:以10%(w/v)水合氯醛按400 mg/kg的劑量經腹腔注射對大鼠實施麻醉。在大鼠頸部中線由下頜至胸骨實施切口，將頸部肌肉向旁剝離以便暴露頸總動脈。將Dermalon 3-0號單纖維手術縫線末端用熾熱前狀態的金屬片烙約1 s，使末端鈍化，然后在距末端20 mm處標記。雙側頸總動脈以微型血管夾斷流，在右側頸內動脈和頸總動脈的分叉附近切口，將端頭鈍化處理的手術線插入，沿頸內動脈上行約20 mm，遇阻力后即停止。腦缺血狀態持續45 min，然后將微型血管夾和手術縫線撤除，使再灌注保持12 h。

1.2 BDNF的應用及ERK信號通路的阻斷 冷凍干燥的BDNF蛋白結晶和選擇性Raf-1抑制劑均由美國國立精神衛生研究所生物標記實驗室贈送。將BDNF溶于pH7.4磷酸鹽緩沖液配成1μg/μl的溶液備用。將Bay 43-9006溶于二甲基亞砜(DMSO)配成5 ng/μl的溶液備用。A組大鼠在進入IR之前6 h，在每只大鼠的右腦室注射2μl pH7.4磷酸鹽緩沖液;B、C兩組大鼠在進入IR之前6 h，在每只大鼠的右腦室注射2.0μg BDNF。A、B兩組大鼠在進入IR之前12 h，在每只大鼠的右腦室注射2μl DMSO，C組大鼠在進入IR之前12 h，在每只大鼠的右腦室注射10 ng Bay 43-9006。

1.3 腦損傷的組織化學評估 對每個大鼠按常規步驟開顱及分離腦，切除嗅球及少量頂端前額葉組織，然后切取額葉，固定48 h，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，每隔1 mm行額狀切片并進行編號。切片經常規甲酚紫染色和顯微拍照后，采用Image-Pro Plus(Media Cybernetics，v6)圖像分析確定和比較腦損傷的面積〔5〕進行。腦損傷的程度以組織損失的百分比表示。

1.4 蛋白免疫印跡雜交 根據本課題組既往報道〔6〕的方法進行，針對組織特點進行了適應性改變。將約100 mg腦組織浸入1 ml冰冷的裂解緩沖液，勻漿后通過Virtis超聲細胞粉碎儀進行超聲剪切(設置2.0，處理1 s×10次)，然后離心5 min去除不溶性沉渣。蛋白濃度測定采用Pierce公司BCA蛋白試劑盒進行。等量的蛋白加入到8% ～16%SDS-PAGE進行電泳分離，然后電轉移至硝酸纖維素膜。硝酸纖維素膜上的非特異結合通過以下雜交液屏蔽。雜交液包括Tris緩沖鹽水，0.1%吐溫-20，5%脫脂牛奶。ERK抗體(抗 ERK 1/2，即抗 p44/p42)，磷酸化ERK抗體(抗202位蘇氨酸磷酸化的ERK 1/2)購自Santa Cruz生物技術公司，實驗中采用1∶500的比例稀釋。次級抗體為辣根過氧化物酶耦聯的抗山羊(運用于ERK1/2)或抗兔(運用于pERK1/2)抗體。免疫復合物用Amersham ECL加強型試劑盒探測。免疫印跡的定量分析采用Syngene凝膠建檔及分析系統進行。

1.5 統計學方法 采用SPSS11.5軟件進行ANOVA，Tukey Post-Hoc及t檢驗。

2 結果

2.1 BDNF對于IR損傷具有明顯的保護作用 在單純IR損傷組(A組)，腦組織損傷面為(16.48±5.72)%;在使用BDNF預處理的情況下(B組)，腦組織損傷面為(6.32±3.08)%，較A組顯著減少 (P=0.039);與未使用BDNF的A組比較，損傷面積減少到原來的38.3%。然而，在使用BDNF的同時使用選擇性Raf-1抑制劑(C組)，則BDNF的神經保護作用被明顯稀釋，腦組織損傷面積又回升到(11.40±3.28)%，與A組已經不構成顯著差別。

2.2 Bay 43-9006抑制ERK通路的活性水平 B組和C組使用了相同劑量的BDNF預治療，但C組同時使用了選擇性Raf-1抑制劑Bay 43-9006。因為Raf-1是ERK信號通路中的重要信號分子，因此，以磷酸化水平所代表的ERK信號傳導活性水平顯著降低。ERK1(p44)的磷酸化水平由B組的(51.73±13.06)%下降至C組的(25.34±12.12)%，具有高顯著性差異(P=0.008 4)。ERK2(p42)的磷酸化水平由B組的(81.16±17.03)%下降至C組的(50.42±14.56)%，差異亦具有顯著性(P=0.029)。

3 討論

因既往研究顯示BDNF的神經保護作用經由ERK信號傳導通路介導〔7〕，因此在本文觀察到BDNF對IR損傷的保護作用之后，在機制方面聚焦到ERK信號傳導。與筆者的理論預計一致，當ERK信號通路上的Raf-1這一關鍵信號分子被Bay 43-9006選擇性抑制后，BDNF的神經保護作用也被顯著抵消。綜合以上觀察結果，筆者推論，在腦IR過程中，ERK信號傳導介導了BDNF的神經保護。但這一推論仍然只能作為一個具有局限性的初步結論，是一個深入研究的起點。Bay 43-9006的生物學活性并非僅限于Raf-1信號分子的抑制〔8〕，因此目前的研究結果需要謹慎解釋。

IR損傷的病理機制廣泛而復雜，在分子病理水平上尤其如此，這其中涉及多個信號傳導通路、細胞因子和神經遞質等〔9〕。在腦IR損傷中，ERK的激活具有促進DNA修復、抑制細胞凋亡、保護神經元的作用〔10〕，具有潛在的臨床運用價值。其實，對ERK通路的調節不僅有BDNF，還有其他很多的分子、受體、細胞因子、激素等，甚至一些心血管藥物也同樣具有ERK的調節作用〔11〕。積極利用這些調節途徑，促進IR損傷的修復和相應疾病的預后，會對治療諸如缺血性腦中風等心腦血管疾病具有積極的促進作用。

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7 Mohajerani MH，Sivakumaran S，Zacchi P，et al.Correlated network activity enhances synaptic efficacy via BDNF and the ERK pathway at immature CA3 CA1 connections in the hippocampus〔J〕.Proc Natl Acad Sci U SA，2007;104(32):13176-81.

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11 紀 紅，郭威早，嚴之紅.洛伐他丁對心肌細胞外信號調節激酶信號傳導水平及心臟營養素-1表達的影響〔J〕.中國臨床醫學，2011;18(3):310-3.