動物源多殺性巴氏桿菌耐藥性及耐藥機制研究進展

孔令聰，戰 利，趙 晴，高云航，馬紅霞，2

(1.吉林農業大學動物科技學院，長春 130118;2.吉林農業大學動物生產及產品質量安全教育部重點實驗室，長春 130118)

多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida，Pm)是引起多種畜禽巴氏桿菌病的病原體，該病以高熱、肺炎為主要特征[1]，Pm可以在同種或不同種動物間相互傳染，也可感染人。在我國，引起禽和豬巴氏桿菌病的主要病原是莢膜血清A型Pm，引起牛巴氏桿菌病的主要病原是莢膜血清B型Pm。隨著病原菌在不同種屬動物間的相互感染，血清型也可能隨之發生改變。我國的馬文戈等[2]首次從病牛組織中分離得到莢膜A型Pm。

動物源Pm不同血清型間的抗原性、宿主嗜性存在著明顯的差異，菌間交互免疫效果較差[3]，使其引發的疾病更依賴于抗生素的治療。隨著大量抗菌藥物廣泛不合理的應用，特別是將抗菌藥物作為抗菌生長促進劑以次治療劑量添加到飼料中，使動物源Pm表現為耐藥率高、耐藥范圍廣、呈多重耐藥等特點，其直接后果不僅給控制和治療該病帶來困難，而且加劇了抗生素在動物體內的殘留，嚴重危害了動物食品安全[4]。

1 動物源Pm的耐藥性研究現狀

動物源Pm的耐藥，尤其是多重耐藥問題已經引起了人們的廣泛關注。因而許多國內外的臨床工作者積極開展了動物源Pm的耐藥性檢測研究。

1.1 國外部分地區動物源Pm的耐藥性研究Dwight C Hirsh等在美國加州的戴維斯市從臨床上分離得到5株雞源Pm，其中有3株對鏈霉素耐藥，4株對磺胺嘧啶耐藥，其耐藥株的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)均大于128 μg/mL[5]。Cardenas M 等在西班牙分離到 1 株對喹諾酮敏感的羊源Pm，用逐漸增加抗生素濃度的方法誘導培養，其誘導后的菌株MIC增加了10倍以上[6]。Kehrenberg C等在德國臨床分離到牛源Pm，并進行耐藥監測，結果顯示所分離菌株均對氯霉素和氟苯尼考耐藥，其MIC分別為32 μg/mL和16 μg/mL[7]。San Millan A 等從西班牙的首都馬德里分離到禽源Pm，發現其對β-內酰胺耐藥的菌株都伴隨著對四環素、鏈霉素、磺胺類耐藥，且所分離菌株對阿莫西林和磺胺類的MIC已經高達256 μg/mL[8]。

1.2 國內部分地區動物源Pm的耐藥性研究 金天明在我國吉林地區分離到禽源Pm，并應用26種抗生素對病原菌進行了藥物敏感性試驗，結果表明，該菌株對慶大霉素、復方新諾明、頭孢氨芐、頭孢唑啉、四環素、依諾沙星等21種抗生素產生耐藥性[9]。Tang X等在中國部分地區分離得到233株豬源Pm，并對20種臨床常用藥物做了藥敏試驗，結果顯示，70%的菌株對阿莫西林、林可霉素、磺胺二嘧啶、新諾明呈高度耐藥;20%的菌株對大觀霉素、卡那霉素、新霉素、慶大霉素、替米考星耐藥，其對阿莫西林、大觀霉素、替米考星、氯四環素、鹽酸環丙沙星的MIC已達128 μg/mL[10]。吉林農業大學動物科技學院實驗室自2010年以來從我國吉林、內蒙古、湖北、河北等省份分離得到牛源多殺性巴氏桿菌12株，分離菌株的耐藥性檢測結果顯示，所有菌株都對新諾明和鏈霉素高度耐藥，其MIC均大于256 μg/mL，從吉林和湖北分離得到的菌株對臨床治療常用的喹諾酮類和大環內酯類抗生素亦產生了耐藥性，其MIC均為64 μg/mL。

從以上文獻可知，不同國家和地區分離的動物源Pm，對常用的各種抗生素均顯示出不同程度的耐藥性，且獸醫臨床使用頻率較高的抗生素產生的耐藥性較高。動物源Pm的耐藥性存在著一定的地域差異性，這可能跟不同國家和地區在動物治療中所使用或在飼料中添加的抗生素的種類以及使用方法、對藥物的用量標準不同有關，從而造成了不同國家和地區動物源Pm的耐藥性有所差異。

2 動物源Pm的耐藥機制

目前，國內外學者研究發現動物源多殺性巴氏桿菌的耐藥可能與耐藥質粒、耐藥基因的突變、外排泵的過量表達、整合子介導等因素有關。

2.1 質粒介導的動物源Pm的耐藥 根據目前的研究結果，動物源Pm的耐藥主要由質粒介導，其質粒攜帶的耐藥基因在細菌間穿梭，使其不斷產生耐藥性。Corinna等[11]報道，從臨床分離的牛源 Pm耐藥株存在10.8 kb的耐藥質粒(Pcck381)，通過限制性內切酶酶切、克隆和序列分析發現該質粒只介導氟苯尼考和氯霉素耐藥，其與3.2 kb的大腸桿菌耐藥質粒(Pmbsf1)有很高的同源性，該質粒的耐藥性是由floR基因所介導的，且該基因與先前報道的floR基因同源性高達99.7%。

Corinna等[12]通過PCR和轉化對從德國分離的耐氟苯尼考的2株豬源Pm和1株牛源Pm進行耐藥機制分析，結果發現其中2株含有耐藥質粒(Pcck381)，1株含有攜帶 floR基因的質粒(Pcck1900)，floR基因存在于鏈霉素耐藥基因strA和strB的下游，其所介導的氟苯尼考的耐藥性與2005年報道的英國耐藥株耐藥性相同，通過脈沖電泳分析，其所介導的氟苯尼考的耐藥表型取決于質粒的水平轉移，而不是病原菌的傳播。

2.2 基因突變介導的動物源Pm的耐藥 抗菌藥物作用位點的改變或新作用位點的產生可能是細菌對某一類具有相同或相似結構抗菌藥物耐藥的最主要因素。Cardenas M等在西班牙分離到1株對喹諾酮敏感的羊源Pm，用逐漸增加抗生素濃度的方法誘導培養，其誘導后的菌株MIC增加了10倍以上，通過PCR擴增誘導前后菌株的gyrA基因，發現其喹諾酮耐藥決定區(QRDR)第83位氨基酸由絲氨酸突變成了異亮氨酸[6]，其符合QRDR區單點突變規律[13]，但其他源多殺性巴氏桿菌對喹諾酮類耐藥是否也與QRDR區的位點突變有關，有待于進一步研究。

金天明等[9]通過PCR分別擴增禽源Pm敏感株和耐藥株的鏈霉素耐藥基因StrA和磺胺耐藥基因SulⅡ，經過克隆和核苷酸序列測定，結果表明，耐藥株Pm對鏈霉素和磺胺耐藥性的差異與StrA和SulⅡ基因突變有關(耐藥性較高的菌株，其突變頻率較高)，且試驗中所有耐藥株均為StrA基因編碼的第204位氨基酸處發生突變，在SulⅡ基因編碼的第159、246、384、584、590、591、597、582 位氨基酸處存在突變，這些基因的突變可能是導致Pm對鏈霉素和磺胺類產生耐藥的主要因素。

2.3 外排泵介導的動物源Pm的耐藥 藥物外排泵(主動外排系統)是能將有害底物排出菌體外的一組轉運蛋白，其過量表達可引起細菌對抗生素耐藥。隨著人們對細菌細胞膜上的外排泵介導耐藥研究的深入，多殺性巴氏桿菌的耐藥尤其是多重耐藥的研究進入了更深的層次，然而藥物主動外排機制在動物源Pm中的作用還未得以充分闡明。

目前，少數文獻報道動物源Pm對四環素的耐藥主要是Tet蛋白的表達導致細菌藥物外排系統的產生，進而使Pm對四環素以及類似藥物產生耐藥性，其機制與枯草芽孢桿菌的bmr基因編碼的外排蛋白Bmr極為相似[14]。Corinna等對耐四環素的豬源Pm進行PCR擴增耐藥基因和雜交實驗，結果發現，在24株Pm中，有2株在染色體DNA上檢測到tet(H)基因，但是只有1株攜帶兩個拷貝的tet(B)基因，它是進入細菌的決定基因，其耐藥性由此基因決定[15]。Kehrenberg C等首次在牛源 Pm中發現了編碼膜外排蛋白點的tet(L)基因，該基因存在于質粒Pcck3259中，其與攜帶tet(B)基因的質粒 Pcck647 極為相似[16]。

Tamas Hatfaludi等在禽源 Pm中發現了pm0527和pm1980兩種蛋白，其與細菌的Acra-Tolc主動外排系統的Tolc很相似，通過系統發育樹分析，其都屬于TolC成員，并確定其與主動外排系統有關。但是否與AcrAB-tolC一樣，其高水平的表達能表現出對化合物耐受，以及其外排底物包括四環素類、氯霉素、紅霉素和氟喹諾酮類，還需要進一步的研究[17]。

2.4 整合子(基因盒系統)介導的動物源Pm的耐藥 整合子介導的細菌耐藥機制，因其能解析耐藥基因的高效快速傳播而受到高度關注[18-19]。目前在革蘭陰性菌中已經研究的整合子有四類，每一類都含有不同的int基因，Ⅰ類整合子較為普遍，它可以攜帶多個耐藥基因，可編碼產生對氨基糖苷類、氯霉素類、大環內酯類、磺胺類耐藥。

Corinna Kehrenberg 等[15]從臨床分離的耐大觀霉素和鏈霉素的牛源多殺性巴氏桿菌中發現了一類整合子的aadA14基因，該基因存在于質粒PCCK647中，將該質粒電轉化到JM109感受態細胞中，結果使其對大觀霉素和鏈霉素都產生了耐藥性，其MIC值分別為512 μg/mL和25 μg/mL。通過系統發育樹比對，該基因與其他細菌的aadA14的同源性相距甚遠，其最近的同源簇也只能達到57%，但在德國分離的4株耐大觀霉素的牛源Pm耐藥株中卻沒有發現aadA14基因。該基因是否是通過攜帶基因盒的整合子插入到該質粒上，以及插入基因盒的類型和順序并沒有得到進一步的闡明[11]。

Kristina Kadlec等[20]對臨床分離的多重耐藥的牛源Pm進行完整基因組測序，并首次發現了其菌體基因組上存在對大環內酯類產生抗性的基因，分別是rRNA甲基化酶基因erm(42)、大環內酯轉運基因msr(E)、大環內酯磷酸轉移酶mph(E)。大多革蘭陰性菌可以產生染色體介導酶和質粒介導酶，例如頭孢菌素酶、廣譜酶，但在多殺性巴氏桿菌中還沒有類似的報道。

總之，動物源Pm的耐藥機制日益被人們所重視，探討動物源Pm多重耐藥性的產生及其傳播機制，從而為有效地控制耐藥基因的傳遞和表達，建立快速診斷細菌耐藥性方法，以及為指導新藥的研發奠定理論和實踐基礎。耐藥尤其是多種治療藥物共同作用下，由基因突變、質粒介導、整合子介導和主動外排所表現出的多重耐藥性及其耐藥機制將是今后的研究熱點。

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