模式識別受體及其相關分子佐劑研究進展

戴志紅，蔣 卉，李 翠，魏 津，郭彩云，關孚時，王在時

(中國獸醫藥品監察所，北京 100081)

疫苗免疫一般認為是防治動物傳染病最有效和最經濟的手段之一。然而，傳統疫苗和新型疫苗也遇到了一些難以解決的問題:疫苗對某些群體的免疫效力低下;需要反復免疫才能產生較好的免疫力;疫苗保護力易隨時間推移而嚴重降低;甚至某些傳染病尚無有效疫苗防治等。因此，很多疫苗，尤其是亞單位疫苗、DNA疫苗和多肽疫苗等新型疫苗必須產生更強大和更持久的免疫反應才能滿足需要。佐劑作為能夠提高疫苗免疫效果的一類重要物質，受到了廣泛研究和應用。近年來模式識別受體(Pattern recognition receptors，PRRs)的不斷發現及其免疫機理的深入探索，為尋找更加高效、安全的新型佐劑開辟了新的道路。其中，很多分子佐劑的快速研究和開發就得益于PRRs研究所取得的成果。

1 模式識別受體(PRRs)研究進展

美國免疫學家Janeway于1989年提出了著名的模式識別理論[1]，認為某些病原體或其產物共同具有在進化上高度保守的特定分子結構，這種高度保守的分子結構稱為病原相關分子模式(Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，PAMPs能被固有免疫細胞的相應受體(即PRRs)所識別并釋放信號，效應細胞依據信號的強弱和特異性調節適應性免疫反應。因此，PRRs只識別微生物特有的PAMPs而不識別宿主結構。PRRs主要有兩類:一類是膜結合受體，如Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)、清道夫受體(Scavenger receptors，SRs)、甘露糖受體(Mannose receptors，MRs)和髓系細胞觸發受體(Triggering receptors expressed on myeloid cells，TREMs)等，可識別胞外微生物，然后活化細胞內信號來激發機體的免疫反應;另一類是細胞內受體，包括 NOD樣受體(NOD-like receptors，NLRs)和RIG-Ⅰ樣受體(RIG-Ⅰ Like receptors，RLRs)。這些PRRs起著“觸發”免疫反應、啟動信號轉導通路的關鍵作用，其分子結構與功能研究所取得的重大進展，為揭示復雜的免疫反應機制及開發新型佐劑尤其是分子佐劑奠定了基礎。

1.1 Toll樣受體(TLRs)TLRs最早發現于果蠅，后來在脊椎動物以及無脊椎動物都發現有TLRs，在細菌和植物等生物界中也發現有TLRs，因此TLRs是最古老、最保守的免疫系統組成部分[2]。TLRs具有相似的結構特征，均為膜結合受體，由胞外區、跨膜區和胞內區3個功能區組成。胞外區序列差異大，是與配體結合的特異部位，主要包括十幾至二十幾個串聯的富亮氨酸重復基序(Leucinerich repeats，LRRs)，其間有非LRR序列分隔;跨膜區富含半胱氨酸;胞內區與白介素1受體(Interleukin-1 receptor，IL-1R)的胞內區結構相似，稱為TLR/IL-1R同源區(TLR/IL-1R homologous region)。TLRs因表達部位不同分為兩類:表達于胞膜的 TLRs(如 TLR1、2、4、5、6、11)和表達于胞質內體和吞噬溶酶體膜的TLRs(如TLR3、7、8和9)。TLRs在淋巴組織和非淋巴組織均有表達，但在不同的組織和細胞表達量有所不同。人類中目前至少發現了11種TLRs，每個TLR相關的信號通路可能是完全不相同的。如TLR1和TLR2或TLR6的二聚體識別革蘭氏陽性菌的肽聚糖、脂蛋白和脂磷壁酸及真菌的酵母聚糖[3];TLR4識別大多數細菌的脂質體及其衍生的單磷酸化脂質;TLR5能識別鞭毛蛋白[4];TLR3能識別病毒雙鏈 RNA;TLR7、8和9分別識別單鏈RNA和細菌或病毒的CpG DNA[5-6];TLR11僅在小鼠中能識別弓形蟲的抑制蛋白[7]。TLR3、7和9能調節 I型 IFN，刺激有效的Th1反應和CTL;TLR4和TLR8能誘導產生IL-6和IL-12等促炎癥因子;TLR2能刺激Th2或Treg反應[8]等。此外，TLR配體也能增強抗體反應，如TLR9的配體CpG ODN能直接激活B細胞、NK細胞，刺激脾淋巴細胞釋放 IL-6、IL-12、IFN-γ等，其他TLR的配體也有類似的免疫調節作用。

1.2 NOD樣受體(NLRs)NLRs屬于胞內模式識別受體，由三個部分組成:N端的效應域用于結合下游的效應分子，中間的寡聚域介導自身的寡聚反應，而C端富含LRRs，則能夠識別配體。目前確定的哺乳動物的NLRs至少有23種，根據N端效應域的不同進行分類:為胱冬肽酶募集結構域(Caspase recruitment domain，CARD)的屬于NOD蛋白;為熱蛋白結構域(Pyrin domain，PYD)的屬于 NALP(NACHT，leucine-rich repeat and pyrin domaincontaining protein，NALP);為桿狀病毒細胞凋亡抑制蛋白重復序列(Baculovirus inhibitor of apoptosis protein repeats，BIR)的屬于 NAIP(NLR family，apoptosis inhibitory protein，NAIP)[9-11]。其中研究最多的是NOD1和NOD2蛋白，NOD1特異性識別大多數革蘭氏陰性菌中含有二氨基庚二酸的肽聚糖，NOD2識別革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌胞壁肽中的胞壁酰二肽(MDP)。NOD1識別固有免疫信號，激活抗原特異性的T細胞和抗體反應，其中以Th2反應為主[12];NOD2對TLR-2介導的NF-κB信號通路，IL-12和Th1反應有負調節作用。NALP5和IPAF主要識別鞭毛蛋白;NALP1、2和3等NLRs識別病原體，激活多蛋白質復合體，并進一步激活半胱天冬酶1(Caspase 1)和調節IL-18和IL-1β或Th2型細胞因子IL-33;NAIP5與半胱天冬酶1依賴的巨噬細胞識別鞭毛蛋白相關。

1.3 視黃酸誘導基因Ⅰ樣受體(RLRs)RIG-I樣受體(RLRs)也屬于胞內模式識別受體，能夠識別細胞質中的病毒RNA，通過RLR級聯信號誘導IFN和促炎癥細胞因子的產生，對抗病毒天然免疫的建立起著非常重要的作用。RIG-Ⅰ樣受體包括3個成員，即視黃酸誘導基因Ⅰ(Retinoic acid inducible gene-Ⅰ，RIG-Ⅰ)、黑色素瘤分化相關基因 5(Melanoma differentiation associated gene 5，MDA5)以及LGP2(Laboratory of genetics and physi-ology 2)。RIG-Ⅰ和MDA5的基本結構是N端為CARD，C端為帶有DExD/H框的RNA解旋酶結構域。LGP2與RIG-Ⅰ和MDA5同源，但缺少CARD的解旋酶。LGP2包含阻遏結構域，可能是固有免疫的控制開關。RLRs表達于各種病毒感染細胞，直接識別和感知進入胞質的病毒成分。病毒感染時，細胞內大量產生雙鏈 RNA，由 RIG-Ⅰ和MDA5識別雙鏈RNA后激活NF-κB和IRF-3/7信號通路，從而誘導具有抗病毒作用的Ⅰ型干擾素的產生，即采用TLR3相似的機制共同介導抗病毒效應。MDA5和RIG-Ⅰ識別不同類型的雙鏈RNA，MDA5識別poly(I:C)，RIG-Ⅰ識別被轉錄的雙鏈RNA。一般認為在哺乳動物中，LGP2在RIG-I/MDA5介導的信號通路中起著負調控作用，然而也有研究表明LGP2作為RIG-I/MDA5信號通路的上游信號在抗病毒感染中起著正調控的作用[13]。

1.4 其他受體 抗原遞呈細胞還表達與識別、捕獲抗原相關的其他受體，如清道夫受體(SRs)、甘露糖受體(MRs)、髓系細胞觸發受體(TREMs)等。SRs主要表達于巨噬細胞表面，是一種三聚體形式的跨膜糖蛋白，不僅參與固有免疫，而且活躍于脂蛋白的代謝，其多聚陰離子結構域能識別病原體和宿主成分，如凋亡細胞和修飾過的低密度脂蛋白[14]。MRs表達于巨噬細胞、樹突狀細胞、平滑肌細胞等多種細胞表面，為單鏈跨膜分子，可識別細胞表面或病原體細胞壁上的多種糖分子，通過參與受體介導的內吞作用和吞噬作用，維持機體組織內環境穩定、參與非特異性免疫防御、誘導特異性免疫應答和調節免疫反應等。然而，清道夫受體和甘露糖受體主要不是識別病原，而是區別自身和非自身。TREMs是新近發現的主要位于單核/巨噬細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞、破骨細胞、小膠質細胞、內皮細胞等細胞表面的免疫球蛋白超受體家族受體。迄今為止得到證實的至少有3種，即TREM-1、TREM-2、TREM-3。TREM-1 與 TREM-3作用相似，在炎性反應的觸發和放大過程中起著重要的作用。TREM-2最初是在人類未成熟的樹突狀細胞上發現的，目前其功能并不十分確定。

2 PRRs相關分子佐劑的研究進展

迄今，人們己經發現許多物質具有免疫佐劑活性，但只有少數在實際中使用，大量具有免疫佐劑活性的物質由于造價高昂或毒副性作用等而限制了其實際應用。為尋找更加高效、安全、廉價而又使用方便的新型佐劑，全世界的科研人員都不斷進行著大量研究，尤其圍繞PRRs進行了很多相關分子佐劑的開發和應用。分子佐劑是指那些能非特異性改變或增強機體對抗原特異性免疫應答的各種免疫相關分子和本身就具有免疫刺激效應的分子(如CpG DNA)。以下重點介紹與PRRs直接相關的分子佐劑，主要包括TLR激動劑、NLR激動劑、RIG-Ⅰ和MDA5激動劑及CD40和腫瘤壞死因子受體超家族(TNFRSF)激動劑等。

2.1 TLR激動劑 能結合并激活TLRs的物質稱為TLR激動劑。髓系樹突狀細胞表達的TLR3、TLR4 和 TLR7，可以對激動劑 poly9(I:C)、LPS、氨基咪唑喹啉產生應答，上調共刺激分子和IL-12的產生，但不產生IFN-α。與此相反，漿細胞樣樹突狀細胞表達的TLR7和TLR9可以對激動劑氨基咪唑喹啉和CpG ODN(CPG oligodeoxynucleotides，CpG ODN)產生應答，上調共刺激分子和大量產生IFN-α[15]。IFN-α 因可以促進 CD8+T細胞的發育而顯得非常重要[16]。對鼠骨髓樹突狀細胞而言，TLR3激動劑、TLR9激動劑、poly(I:C)和CpG ODN可以激活這些細胞向MHC-I限制性 CD8+T細胞交叉呈遞外源抗原[17]，而其他TLRs激動劑則不行。激動劑在CD4+輔助T細胞存在的前提下可以促進CD8+T細胞的產生[18]，如果沒有CD4+輔助T細胞的存在，或CD8+T細胞在最初受到刺激時沒有CD40刺激因子，CD8+T細胞應答將隨時間推移而減弱[19]。TLR激動劑可對樹突狀細胞和巨噬細胞產生短暫刺激，但在體外，該刺激作用在信號給予24 h后便會逐漸減弱。只有通過緩釋的方式，才可以使TLR激動劑打破機體的耐受性，然而即使在耐受性調節T細胞(Treg)存在時，LPS的反復刺激(每天1次連續4 d)仍可以誘導有效的抗腫瘤CD8+T細胞應答[20]。蛋白質抗原可以與TLR激動劑直接結合誘導強烈的抗原特異性應答[21-23]。

2.1.1 TLR3激動劑 TLR3信號是通過TRIF途徑誘導產生細胞因子[24-25]。盡管病毒雙鏈 RNA可以刺激TLR3，但TLR3最有效的激動劑是poly(I:C)。學者們已對poly9(I:C)進行了長達35年之久的研究，并在人身上進行了廣泛的測試。poly(I:C)作用原理主要有兩種解釋:poly(I:C)進入細胞質與RIG-I或MDA5反應介導產生Ⅰ型干擾素[26];poly(I:C)進入非漿細胞樣傳統髓系樹突狀細胞的細胞質后，與雙鏈RNA依賴性蛋白酶R(PKR)反應，通過一種非 PKR、非TLR3途徑介導產生Ⅰ型干擾素。poly(I:C)可以不與樹突狀細胞表面的TLR3受體作用而通過電穿孔術或脂質體轉染進入胞漿。因此，poly(I:C)的轉運方式對其誘導細胞產生應答有很大影響[27]。

2.1.2 TLR4激動劑 TLR4可以通過MyD88和TRIF途徑介導細胞反應[24-25]。Napolitani等報道TLR4能激活人的髓系樹突狀細胞[28]。細菌LPS是最經典的TLR4激動劑。為減少TLR4激動劑的毒性，研制了單磷酰脂質A，目前已作為一種有效的分子佐劑而成為人用佐劑GlaxoSmithKline AS02A 的一種成分[29]。

2.1.3 TLR7和TLR8激動劑 由于物種差異，R-848是小鼠TLR7的激動劑，卻是人類TLR8的激動劑。另一個區別就是，TLR7激動劑可刺激人漿細胞樣樹突細胞產生IFN-α，而TLR8激動劑可激活人髓系樹突狀細胞，單核細胞和單核細胞來源的樹突狀細胞，產生促炎癥反應細胞因子和趨化因子，如 TNF、IL-12、MIP-1[30]。Poly-G10 作為一種TLR8激動劑，可以關閉CD4+CD25+Treg的免疫抑制功能[31]。

2.1.4 TLR9激動劑 非甲基化的CpG ODN是典型的TLR9激動劑。不含CpG基序的ODN稱為ODN免疫刺激序列。ODN可以不被核酸酶降解，并具有更強的細胞滲透性。DNA疫苗免疫時，質粒DNA介導的免疫刺激反應有可能是CpG基序的作用，但目前仍不清楚該反應是否始終是作用于TLR9的結果[32]。小鼠的漿細胞樣樹突細胞和髓系樹突狀細胞均有TLR9，而人類只有漿細胞樣樹突細胞存在。TLR9在小鼠和人之間的分布不同，導致TLR9激動劑在小鼠體內的多種作用無法應用到人類的臨床試驗。令人慶幸的是，人類至少有兩條基于CpG ODN的TLR9+漿細胞樣樹突細胞免疫刺激途徑來激活TLR9-髓系樹突狀細胞。Gerosa等[33]發現被CpG ODN、人漿細胞樣樹突細胞激活的NK細胞，可以通過NK細胞-髓系樹突狀細胞-細胞聯系途徑來熟化髓系樹突狀細胞，完成抗原呈遞和IL-12p70表達。Gautier等[34]還發現CpG ODN誘導人漿細胞樣樹突細胞產生的Ⅰ型干擾素，可以激活髓系樹突狀細胞來增強IL-12p70的表達。在疫苗臨床試驗中TLR9激動劑的有效性可能就與這兩條途徑中的一條或兩條有關。

2.2 NLR激動劑 NLR激動劑能促進IL-1β的加工和分泌。NLR的刺激作用相對比較獨特，它能活化caspase 1，也稱為IL-1β轉化酶(ICE)。盡管許多樹突狀細胞和巨噬細胞能刺激上調細胞漿內的IL-1β前體，但ICE對于IL-1β前體轉化為IL-1β是必需的。與此類似，ICE對于IL-18前體轉化為IL-18也是必需的。IL-1β和IL-18對于活化很多免疫細胞非常重要，因此NLR激動劑可以作為疫苗和免疫刺激物的有效成分。例如，IL-1β協同CD40L可以誘導人 MDDCs產生IL-12，細菌胞壁成分肽聚糖能活化NOD1，MDP能活化NOD2。MDP與NALP-3相互作用可以促進IL-1β 與IL-18前體的酶解過程[35]。細菌 RNA、R-837、R-848在小鼠體內與TLR7結合，可以激活caspase 1，促進鼠類巨噬細胞分泌 IL-1β[36]。

2.3 RIG-Ⅰ和MDA5激動劑 許多NLR蛋白都包含CARD結構域。近來報道一種含CARD的蛋白，分別稱為 IPS-1、MAVS、VISA 和 Cardif，具有RNA解旋酶的結構域，可以作為RIG-Ι激活信號的轉接蛋白。MDA5是另外一種RNA解旋酶，具有與RIG-Ι相似的信號作用[37]。含CARD的蛋白與MDA5通常被劃分在NLR家族，最近卻被歸于RIG樣解旋酶家族[38]。與NLR家族其他成員相似，RIG-I和MDA5也能感知細胞內的微生物產物，譬如，病毒復制產生的雙鏈RNA與RIG-I相互作用激活IRF3(IFN調節因子3)，啟動細胞的抗病毒程序，并產生 Ι型 IFN[26]。

2.4 CD40和腫瘤壞死因子受體超家族激動劑腫瘤壞死因子受體超家族(TNF receptor superfamily，TNFRSF)包括樹突狀細胞、巨噬細胞、T細胞表面的多種重要受體。其中對疫苗研究最有意義的是OX40、4-1BB、CD30、皰疹病毒進入調節因子、CD27和糖皮質激素誘導的腫瘤壞死因子受體相關蛋白(GITR)，它們的配體分別為OX40L、4-1BBL、CD30L、LIGHT、CD27L/CD70 和 GITRL。CD40L 作為CD40配基還可以啟動CD4+T細胞來激活CD8α+樹突 狀細 胞 產生 CD8+T 細 胞[39]。除CD40L外，還有一些分子佐劑可以刺激TNFRSF來激活免疫應答。

2.5 其他分子佐劑 其他一些不直接作用于PRRs的分子佐劑還包括趨化因子、白細胞介素、造血生長因子、干擾素、關閉內源免疫抑制劑等。

3 結語

綜上所述，PRRs是固有免疫系統的重要成分，不同的PRRs是通過不同的信號傳遞途徑識別PAMPs并啟動免疫反應。因此，深入研究各類動物PRRs的分子特征、免疫功能及其信號轉導機制等，對于揭示免疫機理、研制疫苗和開發分子佐劑具有重要意義。

傳統的佐劑對于機體來說屬于外源性物質，不僅可起到免疫刺激作用，也會出現不良反應。理想的佐劑應該不僅可以誘導較強和持久的免疫應答，而且要盡量減少其對機體的不良反應。PRRs的深入研究和相關分子佐劑的開發則為“理想”佐劑的產生開拓出一條新的思路，帶來了新的希望。

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