昆蟲桿狀病毒表達系統生產流感疫苗的研究進展

李晶梅，靖志強，秦紅剛，薛 霜，漆世華，謝紅玲，吳玉石

(武漢中博生物股份有限公司，武漢 430070)

流感病毒是一種造成人類及動物流行性感冒的RNA病毒，分為A、B、C三型。禽流感病毒屬A型流感病毒，主要感染禽類，每年造成養禽業巨大損失。1997年首次證實了禽流感病毒可以直接從禽傳播到人[1]，此后又有多起人接觸發病禽類感染禽流感、發病死亡的報道。禽流感突破種間屏障對人類易感以及2009年墨西哥豬流感爆發，都使得流感再次成為人們關注的焦點。預防接種疫苗是防控季節性流感和大流行流感的首選辦法。目前臨床應用的流感疫苗以雞胚苗為主，但雞胚苗的生產有諸多限制因素，人們一直試圖開發新型流感疫苗，以昆蟲桿狀病毒表達系統(Baculovirus expression vector system，BEVS)表達流感病毒樣顆粒為核心技術的新型流感疫苗已成為國內外研發熱點。

1 昆蟲桿狀病毒表達系統表達流感病毒樣顆粒

病毒樣顆粒(Virus-like particles，VLPs)是各種表達系統表達的由某種病毒的一個或多個結構蛋白自行裝配而成的形態結構類似于病毒粒子的空心蛋白顆粒。VLPs不含病毒核酸，不能自行復制，但作為抗原，以病毒感染一樣的途徑遞送給免疫細胞，有效地誘導機體免疫系統產生免疫反應。流感病毒VLPs是由流感病毒的主要結構蛋白在細胞膜上相互作用出芽形成的。因此，流感病毒VLPs為胞外表達，其研究焦點也集中在基質蛋白M1，以及血凝素(HA)、神經氨酸酶(NA)和基質蛋白M2三種跨膜蛋白上。

昆蟲桿狀病毒表達系統是一種能夠高效表達外源基因的真核表達載體系統。桿狀病毒基因組較大，可容納大片段外源基因，且具有多個天然啟動子，也易于構建新的人工啟動子，實現多基因表達，因此可同時插入多個外源基因表達VLPs。很多研究機構均利用BEVS成功表達了VLPs，如猴或人的免疫缺陷綜合癥病毒VLPs[2-3]、人乳頭狀瘤病毒 VLPs[4]、肝炎病毒 VLPs[5]、輪狀病毒 VLPs[6]、埃博拉病毒VLPs[7]等。目前，采用BEVS組裝流感病毒VLPs主要有兩種方法:一種是分別構建含1～2個流感結構蛋白基因的重組桿狀病毒，將含不同流感結構蛋白基因的重組桿狀病毒共感染到同一宿主細胞組裝成VLPs[8-11];另一種是將多種結構蛋白的基因插入到同一桿狀病毒，感染宿主細胞組裝成 VLPs。HA、NA、M1、M2 四種結構基因[12-13]或 HA、NA、M1 三種結構基因構建到一個桿狀病毒結構內[14-16]，表達流感病毒VLPs都獲得了成功。電鏡下，表達的流感病毒VLPs與流感病毒粒子大小相當、形態學相近，并有流感HA蛋白的典型突起[10，12，16]。

2 BEVS制備的流感病毒VLPs疫苗

BEVS表達流感病毒VLPs，多以疫苗研發為目的。構建的流感病毒VLPs是否具有良好免疫活性是研發中關注的焦點。VLPs單價疫苗、多價疫苗免疫原性研究顯示，流感病毒VLPs與流感全病毒免疫原性相近，高于重組 HA的免疫原性[11，12，14，17-19]。也有研究稱其制備的三價 VLPs 疫苗比三價全病毒滅活疫苗介導了更高的血凝抑制(HAI)抗體，并具有更廣泛的交叉保護[20]。所以從免疫原性因素考慮，VLPs可以用于制備流感疫苗。

流感病毒VLPs是否適合做疫苗的抗原，還需要從不同方面進行考察，科研人員根據不同的側重點設計了各自的實驗。

2.1 交叉免疫保護效果 能產生廣泛的交叉保護是優質疫苗的特性，而流感病毒VLPs是可以具備這種優勢的?；谇菰碒5N1流感病毒構建的VLPs，以鼠為動物模型，能夠激發有效的抗體應答，保護同源禽H5N1流感病毒和異源人H5N1流感病毒的攻擊[21]。H1N1流感病毒VLPs免疫組雪貂攻擊H5N1流感病毒，雪貂發病，但最終全部存活，而對照組雪貂全部死亡[15]，這說明流感病毒VLPs甚至對不同亞型流感病毒也有一定的保護效果。綜合來說，流感病毒VLPs對同源毒株保護效果良好，對同亞型不同分支的流感病毒有的能夠保護、有的則保護效果不佳[9，18]，對不同亞型的流感病毒無保護效果或有微弱效果。

2.2 免疫劑量 流感病毒VLPs的免疫效果與免疫的 VLPs的劑量相關，高劑量 VLPs比低劑量VLPs介導了更高的針對HA的IgG抗體[14]和HAI抗體[22]，攻毒后實驗動物鼻腔病毒載量更低[20]。當達到一定量后，再提高VLPs的劑量，不會再有免疫保護效果的提升。

2.3 接種方式 接種方式研究集中在鼻腔接種和肌肉注射接種兩種免疫方式。不同研究機構、不同毒株、不同衡量指標得到了相同的結論，即鼻腔接種優于肌肉注射接種[15，23]。

2.4 一次免疫和加強免疫 一次免疫和加強免疫相比較，加強免疫的動物免疫保護效果更好，攻毒后體重數據優于一次免疫[10，17]。也有研究顯示，一免后僅部分實驗動物有HAI抗體，二免后全部有HAI抗體[20]。此類加強免疫的相關研究會為制定疫苗免疫程序提供依據。

2.5 免疫持續期 流感病毒VLPs能夠引發長效保護，二免后28周特異性抗體水平未改變，二免后30周的小鼠能夠抵御同源H5N1亞型高致病性禽流感的攻擊[24]。免疫A/PR8 H1N1流感病毒VLPs的小鼠，也在14周后完全抵御A/PR8流感病毒型的致死性感染[19]。在動物上進行的免疫持續期的研究得到了理想的數據，但還需要臨床實驗數據才能最終確定VLPs疫苗能夠提供有效保護的時長。

2.6 多價疫苗與單價疫苗 使用多價疫苗是拓寬保護范圍的最好辦法。分別表達不同亞型的流感病毒VLPs制備多價疫苗，動物實驗證明多價疫苗的保護效果與單價疫苗的效果相當。VLPs制備多價疫苗能夠引發特異性免疫反應，針對的是同亞型的同源株和遺傳關系相近的毒株[19-20]，并且各抗原不相互拮抗。

2.7 佐劑 有研究顯示，免疫純品VLPs即可有很好的保護效果。盡管如此，各研究機構仍致力于佐劑的研究，選用了不同的佐劑意圖提升流感病毒VLPs的免疫效果或節約抗原。研究顯示，添加白細胞介素-12、胞苷酸鳥苷寡脫氧核苷酸(CpG ODN)、非磷脂脂質體納米佐劑(Novasome)的流感病毒VLPs與PBS稀釋的流感病毒VLPs相比較，有更好的免疫效果[8，13，22]。

綜上所述，不同研究機構圍繞流感病毒VLPs是否具有制備流感疫苗的特質，做了大量開發流感病毒VLPs疫苗所需的臨床前研究工作。他們都構建出了有很好的免疫原性流感病毒 VLPs，如H1N1、H3N2、H9N2、H5N1亞型和 B 型流感病毒的VLPs。雖然亞型、毒株、構建方法不盡相同，但都得到了相同的結論，即含有流感主要保護性蛋白(HA和NA)的VLPs展現了流感病毒的功能特性，以其作為抗原制備疫苗免疫動物，攻毒后抵御流感病毒的攻擊、抑制流感病毒復制。

3 昆蟲桿狀病毒表達系統制備流感病毒VLPs疫苗的優勢和應用前景

3.1 流感病毒VLPs疫苗的優勢和風險 與雞胚生產流感病毒相比，BEVS生產抗原有明顯優勢。在具有大體積生物反應器技術、規?；囵B昆蟲細胞制備抗原、保證產量的同時，產品質量的穩定性和均一性也得到保障，并且降低了人力成本;禽流感爆發流行會限制原材料雞胚的供應，使疫苗生產無法供應市場，而細胞放大用于生產，疫苗供應不會中斷，并且細胞培養無廢物處理環節;不涉及活的流感病毒，無生物安全方面隱患;VLPs自我組裝后的宏觀結構所展現的是天然的構象決定簇，對于免疫系統而言，可以和活病毒粒子相媲美[25]。

原材料成本方面，雞胚生產流感病毒使用無特定病原體(SPF)雞胚做原材料，每枚SPF雞胚6～8元，抗原產量8～12 mL，還需核算運輸成本和孵化損失，最終每毫升抗原折合原材料成本1元左右;市售昆蟲細胞培養液價格很高，工業化生產可以直接從培養基生產廠家訂購昆蟲細胞干粉培養基，10 L裝量的干粉培養基價格2000～3000元，最終每毫升抗原折合原材料成本0.2～0.3元。所以與雞胚生產流感病毒相比，BEVS生產抗原也有價格優勢。

利用BEVS研發流感疫苗也有一定技術風險:大體積生物反應器培養昆蟲桿狀病毒，前期設備投入大，操作維護技術含量高，以高抗原產量為目的的生產工藝摸索也有很大不確定性。

3.2 在人用疫苗的應用前景 歐洲藥品審評署(EMEA)和美國食品藥物管理局(FDA)先后允許由BEVS生產的人乳頭瘤病毒VLPs疫苗在人類使用[26-27]，說明 BEVS生產的疫苗，用于人類是受到認可的。表達流感病毒VLPs的重組桿狀病毒的構建技術非常成熟，有很多成功經驗。從分離出突變株的結構蛋白基因到疫苗產品一般需十幾周時間，疫苗上游研發耗時短，能夠應對流感的快速、多突變特性，并且重組昆蟲桿狀病毒合成后，VLPs的生產過程少于1周時間。純化質控工藝可以參考現用流感疫苗，通過密度梯度離心和離子交換層析，獲得VLPs純品。純化的VLPs采用SDS-PAGE光密度掃描法定量，也可以利用粒子構成和血凝分析。

Novavax公司研發的流行性感冒病毒VLPs疫苗正在做一期臨床，其三聯季節性流感病毒VLPs疫苗已進入二期臨床。已公布的結果顯示，兩種疫苗保證安全性的同時都有較好的免疫原性。

3.3 在獸用疫苗的應用前景 禽流感疫苗在獸用疫苗中占有重要份額，是養禽業疫病防控必不可少的疫苗之一。目前，獸用禽流感疫苗為反向遺傳技術構建的疫苗株生產的全病毒滅活疫苗，也是以雞胚作為生產原料，無需抗原精細提純，只經過簡單濃縮純化制備的油包水型疫苗。傳統雞胚疫苗經市場多年驗證，效果確實。核酸疫苗、活病毒載體疫苗、全病毒細胞苗的研究與開發都在火熱進行。獸用流感病毒VLPs疫苗要在激烈的市場競爭中獲得認可，前期的研發工作至關重要。

未經純化的流感病毒VLPs包含有非流感的可溶性蛋白，對致死性攻擊也起到100%的保護，不過比純化的流感病毒VLPs的免疫保護效果差，體現在實驗動物短期體重流失[28]。另外，未經純化的流感病毒VLPs培養液上清內含桿狀病毒，不適宜在純度要求高的人用疫苗使用，在實際應用中，可以考慮將經簡單濃縮純化的流感病毒VLPs用于制備獸用滅活疫苗。目前來看，流感病毒VLPs用于獸用疫苗的相關研究并不是很多。H5N3亞型禽流感病毒VLPs在鴨的研究和H9N2亞型禽流感病毒VLPs在SPF雞的研究顯示，VLPs疫苗在禽類有很好的免疫保護效果，有希望被開發成為新一代禽用疫苗[29-30]。再者，VLPs疫苗不包含核衣殼蛋白(NP)，ELISA檢測NP抗體可以區分疫苗免疫動物和自然感染動物，使淘汰撲殺病禽成為可能，有利于養殖場禽流感的凈化。

與人用疫苗研發不同，獸用疫苗研發使用本動物做安全性評估和免疫效力評估，評估方法成熟，實驗結果認可度高。獸用疫苗特性和動物實驗的優勢，使得獸用流感病毒VLPs疫苗研發和生產成本遠低于人用流感病毒VLPs疫苗。

4 總結

目前，已有多家研究機構和商業公司對BEVS制備的流感病毒VLPs疫苗做了較全面而系統的研究。雖然有各種原理和技術細節有待研究和解決，但此類疫苗仍是備受期待的防控流感的有效疫苗?；谇萘鞲胁《綱LPs獸用疫苗的研究報道甚少，有必要像人用疫苗一樣著手重點研究獸用禽流感病毒VLPs疫苗，從而為未來可能出現的禽流感新疫情提早準備對策。

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