正交試驗優選腎炎消白顆粒提取工藝及中試研究

白海玉，韓德強，楊微，王朝宇

腎炎消白顆粒是我院長期使用的一種醫院制劑，是由黃芪、枸杞子等12味常用中藥組成的純中藥制劑，具有益氣養陰、清熱解毒、利水滲濕的功能，用于慢性腎小球腎炎、腎病綜合征。為了適應進一步擴大生產的需要，現對十年前腎炎消白顆粒工藝進行深一步的研究，因為本處方中黃芪為君藥，黃芪甲苷為其主要活性成分之一，因此本實驗在實驗室研究和中試研究階段擬以黃芪甲苷的含量及總浸膏得率為指標進行綜合分析，以優選其提取工藝。

1 材料與方法

1.1 儀器

P680HPLC高效液相色譜(美國戴安公司);ALL-tech2000ES型蒸發光散射檢測器;北京中惠普分析技術研究所SPB-3全自動空氣源;ZF型三用紫外儀(上海市安亭電子儀器廠)，BT205S型電子天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司);TO200.0型提取罐(常熟市中藥制藥機械總廠);黃芪甲苷對照品(中國藥品生物制品檢定所提供，批號：10781-200512)。

1.2 材料

甲醇、乙腈(色譜純，美國迪克馬公司);其他試劑為國產分析純;黃芪甲苷(批號：10781-200912)購于中國藥品生物制品檢定所;黃芪、枸杞子、益母草等均購于哈爾濱世一堂中藥材飲片廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 正交實驗設計 根據相關資料和有關預試驗結果，本實驗采用L9(34)正交表，對影響提取工藝的主要因素加水量、提取時間和提取次數進行優選。以干膏重量和黃芪甲苷含量為綜合評價指標。腎炎消白顆粒實驗室提取工藝因素與水平的關系見表1。

表1 因素與水平Tab 1 Factors and levels

1.3.2 腎炎消白顆粒黃芪甲苷的含量測定［1-2］

1.3.2.1 色譜條件 Phenomenex C18色譜柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)，預柱(phenomenex，security Guard Cartridges C18 4 mm×30 mm);流動相：乙腈-水(32 ∶68);流速：1.0 ml/min;柱溫：35℃;進樣量：對照品溶液10 μl、20 μl，供試品溶液20 μl;漂移管溫度105℃，氣體流速3.0 L/min。

1.3.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇制成每1 ml含黃芪甲苷0.12 mg的溶液，即得。

1.3.2.3 供試品溶液的制備 將每份按處方比例混合的藥材粗粉約132 g，依照正交設計工藝流程提取，濃縮，放入真空箱干燥，制成提取物干燥粉末。取本品，研細，精密稱取10.021 2 g，加甲醇100 ml，加熱回流至提取液無色，提取液回收溶劑并濃縮至干，殘渣加水20 ml，微熱使溶解，用水飽和正丁醇振搖提取4次，每次40 ml，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2次，每次20 ml，棄去氨試液，合并正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇使溶解并轉移至5 ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

1.3.2.4 陰性對照樣品溶液的制備 取無黃芪腎炎消白處方，按工藝制備無黃芪的陰性樣品，并按“1.3.2.3”方法制備，即得。

1.3.2.5 系統適應性試驗 分別吸取對照品溶液10 μl、20 μl，供試品溶液及陰性樣品溶液各 10 μl注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，按上述色譜條件計算色譜圖，按黃芪甲苷峰計算，理論塔板數為4 000以上。在該色譜條件下黃芪甲苷峰的保留時間為13 min左右，陰性對照樣品溶液在與黃芪甲苷相同的保留時間處未見峰出現，故認為無干擾，黃芪甲苷峰與鄰近峰達到基線分離，分離度良好。

1.3.2.6 標準曲線制備 精密稱取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇制成濃度分別為0.008 5，0.017 0，0.034 0，0.068 0，0.136 0 mg/ml，分別進樣 10 μl，以進樣量的自然對數值為橫坐標(x)，峰面積的自然對數值為縱坐標(y)，回歸方程為y=1.135 1 x+4.220 7，r=0.999 8;黃芪甲苷在 0.085 ～1.256 μg范圍線性關系良好。

1.3.2.7 精密度試驗 精密吸取供試品溶液，重復進樣5次，結果所得黃芪甲苷峰面積的 RSD為1.02%，精密度良好。

1.3.2.8 穩定性試驗 取供試品溶液分別在0，2，4，8，12 h測定，結果所得黃芪甲苷峰面積的RSD為1.05%，表明黃芪甲苷在12 h內基本穩定。

1.3.2.9 重復性試驗 精密稱取腎炎消白顆粒共6 份，按“1.3.2.3”方法制成供試品溶液。結果黃芪甲苷的平均含量為 0.85 mg/1 000 g，RSD為1.60%，重復性良好。

1.3.2.10 加樣回收率試驗 取已知含量的樣品6份，每份5 g，精密稱定。分別精密加入黃芪甲苷對照品0.153 mg/ml，按樣品含量測定項下方法操作，經計算加樣回收率為98.93%，RSD為1.13%，表明本方法測定結果準確可行。見表2。

表2 加樣回收率試驗結果Tab 2 Results of the recovery experiment

2 結果

2.1 正交試驗結果

本實驗采用L9(34)正交試驗法，以出膏率和黃芪甲苷含量作為綜合指標進行方差分析和直觀分析。正交試驗結果與方差分析見表3～5。結果表明，選擇A3B2C3，即加8倍量水煎煮3次，每次2 h為最佳提取條件。

表3 正交試驗結果分析Tab 3 Results of orthogonal test analysis

表4 浸膏率方差分析(α=0.05)Tab 4 Variance analysis on extract

表5 黃芪甲苷含量方差分析(α=0.05)Tab 5 Variance analysis on Astragaloside IV content

2.2 中試試驗結果

中試選擇實驗室優選的實驗結果：加8倍量水煎煮3次，每次2 h。本實驗每次投料15.84 kg，在實驗設計上采用每隔30 min在提取罐的上、中、下不同部位取樣，以干膏重量和黃芪甲苷含量為綜合評價指標。由于中試量較大，此項試驗重復2次，試驗數據見表6。通過中試數據綜合考察出膏率和黃芪甲苷含量因素，確定最佳工藝為加8倍量水煎煮3次，一煎、二煎各1.5 h，三煎1 h為最佳提取條件。

3 討論

本研究通過正交試驗法對腎炎消白顆粒的水提工藝進行了優選，并進行了中試放大，發現二者之間存在一定的差異，中試放大是在實驗室小規模生產的工藝路線確定后，采用該工藝在模擬工業化生產的條件下所進行的工藝研究，以驗證放大生產后原工藝的可行性，保證研發和生產時工藝的一致性。中試放大是藥品研發到生產的必由之路，也是降低產業化實施風險的有效措施，是聯結實驗室工藝和產業化生產的橋梁，可為產業化生產積累必要的經驗和試驗數據，具有重要意義。本研究通過實驗室工藝和中試工藝的比較證明由于熱量傳導、攪拌與傳質等試驗條件的改變會導致兩者之間存在差異，在以后的實踐工作中將進一步客觀、深入地分析和 闡述二者之間產生差異的原因。

表6 中試試驗結果Tab 6 Factors and results of medium enlarge test

［1］中國藥典.一部［S］.2010：283.

［2］丘明明.HPLC-ELSD測定止血靈膠囊中黃芪甲苷的含量［J］.中成藥，2008，30(8)：附6-7.