氯沙坦對機械通氣大鼠肺組織TNF-α和MPO表達的影響

牛志紅，張新日

(山西醫科大學第一醫院呼吸科，太原 030001)

呼吸機所致肺損傷(ventilator-induced lung injury，VILI)是機械通氣最嚴重的并發癥，研究其發病機理和防治措施對提高機械通氣應用水平有重要價值。近年來研究發現，腎素-血管緊張素系統(renin-angiotensin system，RAS)不但在急性肺損傷(ALI)時炎癥反應、氧化應激和細胞凋亡中發揮了重要作用，而且在 VILI發病中也具有重要作用［1-4］。因此，適當應用血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)受體拮抗劑或血管緊張素轉化酶抑制劑對VILI應具有一定防治作用。本實驗通過觀察氯沙坦對機械通氣大鼠肺組織腫瘤壞死因子-α(TNF-α)表達量及髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性的影響，探討氯沙坦對機械通氣肺損傷的抗炎保護作用。

1 材料和方法

1.1 動物分組與模型制備

健康成年雄性 W ister大鼠24只(山西醫科大學動物中心提供，合格證號：SXCK(晉)2009—0001，清潔級)，體重300g～350g，隨機分為3組：①對照組：未行機械通氣；②呼吸機致肺損傷組(VILI組)：潮氣量40m L/kg；③氯沙坦干預組(LAP組)：機械通氣前30min腹腔注射氯沙坦30mg/kg。

大鼠經25%的烏拉坦4m L/kg腹腔注射麻醉后行氣管切開。除對照組外，其余大鼠均通過橡膠管與小動物呼吸機(DH-150型，浙江大學醫學儀器廠制造)相連接行機械通氣。通氣參數：潮氣量 40m L/kg，頻率 60次/min，吸/呼比 1∶3，PEEP為0，吸入氣體為室內空氣，通氣時間為2h。

通氣結束后，腹主動脈放血將大鼠處死，切取肺臟，肉眼觀察肺臟的大體改變，取右肺中葉用中性福爾馬林固定，常規石蠟包埋，行HE染色病理學檢查及TNF-α免疫組織化學染色檢測。取右肺中葉行肺濕/干重(W/D)比值測定。取左肺上葉-20℃保存，用于 AngⅡ含量測定。取左肺下葉-20℃保存，用于MPO活性測定。

1.2 肺組織TNF-α免疫組織化學染色

采用鏈霉親和素-生物素-過氧化酶復合物法(SABC)對肺泡上皮細胞和細支氣管上皮細胞進行TNF-α免疫組織化學染色，具體操作步驟參照試劑盒(購自武漢博士德生物工程有限公司)說明進行。兔抗大鼠抗體工作濃度為1∶100，以磷酸鹽緩沖液代替一抗作陰性對照。結果判斷：陽性染色為細胞漿內出現棕黃色顆粒。在400倍光鏡下對每張組織切片隨機選取5個高倍視野進行觀察。采用 BI-2000醫學圖像分析系統分別檢測每個視野 TNF-α染色陽性細胞的平均光密度值(A)，以上述5個視野的平均值作為該大鼠細支氣管上皮細胞 TNF-α蛋白表達的相對含量。

1.3 肺組織W/D比值測定

取右肺中葉用生理鹽水沖洗干凈表面血跡，再用無菌紗布吸干表面液體后稱重(濕重)，然后置于烤箱中 60℃過夜后再稱重(干重)，計算肺濕/干(wet/dry，W/D)比值。

1.4 肺組織勻漿AngⅡ含量檢測

將肺組織稱重后置于裂解液中，用組織勻漿機打碎后離心，取上清液用 ELISA法測定肺組織中AngⅡ含量。AngⅡ ELISA試劑盒由美國 GBD公司提供，操作過程嚴格按試劑說明書進行。先在酶標儀(Wellscan Mk3，芬蘭)上測出標準品吸光度并繪制出標準曲線，然后測定樣品吸光度并在標準曲線上讀出樣品濃度。

1.5 肺組織勻漿M PO活性測定

將肺組織稱重后制備組織勻漿，采用髓過氧化物酶檢測試劑盒(購自南京建成生物工程研究所)測定肺組織中MPO活性。測定方法及操作步驟按試劑盒說明進行。

采用721分光光度計進行比色，波長460nm，光徑1cm，蒸餾水調零，測定各管吸光度值。MPO活性用酶活力單位表示，即每克組織蛋白在37℃的反應體系中使H2O2分解1μmol為1個酶活力單位。

文氏橋振蕩器,它是由同相放大器和RC串并聯反饋網路組成。具有振蕩較為穩定、波形良好、振蕩頻率在較寬的范圍能方便地連續調節等優點[6]。在文氏橋振蕩器拓撲中增加動態元件、非線性元件或者兩個文氏橋電路通過非線性耦合可構成各類文氏橋混沌或超混沌振蕩電路[10-14]。

1.6 統計學方法

全部數據以均數±標準差表示，采用SPSS 11.5軟件包進行統計學分析，組間差異比較采用方差分析，各組均數間兩兩比較用 SNK-q檢驗，相關性分析采用直線相關分析法，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺組織病理學改變

HE染色光鏡下觀察，對照組大鼠肺泡結構和各級支氣管上皮完整，肺間質無明顯炎癥細胞浸潤。VILI組大鼠可見彌漫性肺間質水腫和炎癥細胞浸潤，肺泡間隔增厚，部分肺泡破裂融合，小血管斷裂，肺泡腔內有血性液體滲出。LAP組大鼠也可見到肺間質水腫和炎癥細胞浸潤，但較VILI組明顯減輕(圖1～3見彩插5)。

2.2 肺濕/干比值測定結果

各組大鼠肺濕/干重比值(W/D)測定結果見表1。結果顯示，VILI組大鼠肺W/D比值均明顯高于對照組和LAP組(均 P＜0.01)；VILI組與對照組比較無統計學意義(P＞0.05)。

2.3 肺組織AngⅡ含量檢測結果

2.4 肺組織TNF-α免疫組織化學染色測定結果

各組大鼠肺組織細支氣管上皮細胞TNF-α免疫組織化學染色測定結果見表1和圖4～6，(圖1～6見彩插5)。結果顯示，VILI組大鼠肺組織TNF-α表達水平明顯高于對照組和LAP組(均P＜0.01)；LAP組與對照組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。

2.5 大鼠肺組織勻漿中M PO活性測定結果

各組大鼠肺組織勻漿中MPO活性測定結果見表1。結果顯示，VILI組大鼠肺組織勻漿中MPO活性明顯高于對照組和LAP組(均P＜0.01)；LAP組與對照組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。

2.6 肺組織TNF-α蛋白表達與AngⅡ含量的相關性分析

相關分析結果表明，對照組與VILI組大鼠肺組織TNF-α蛋白表達與肺組織AngⅡ含量之間呈正相關(r=0.681，P＜0.05)。

表1 各組肺濕/干比重、AngⅡ含量、TNF-α表達水平及MPO活性的比較(±s)Tab.1 Comparison of W/D，AngⅡ content，TNF-α level and MPO activity in all groups(±s)

表1 各組肺濕/干比重、AngⅡ含量、TNF-α表達水平及MPO活性的比較(±s)Tab.1 Comparison of W/D，AngⅡ content，TNF-α level and MPO activity in all groups(±s)

注：與對照組比較：*P＜0.01；與 VILI組比較：#P＜0.01；與對照組比較，##P＜0.01。NOTE：*P＜0.01，compared with the control group；#P＜0.01，compared with the VILI group；##P＜0.01，compared with the control group.

檢測指標(Indexes)對照組(Control group) VILI組(VILI group) LAP組(LAP group)例數n 888肺濕/干比重(W/D) 4.389±0.065 8.546±0.374* 4.711±0.194# AngⅡ含量(AngⅡcontent) 112.051± 7.777 451.159± 19.803* 457.660± 15.660## TNF-α水平(TNF-α level) 0.133±0.017 0.655±0.029* 0.166±0.023# MPO活性 U/L (MPO activity) 1.638±0.027 6.762±0.423* 1.677±0.026#

3 討論

近年來，腎素-血管緊張素系統(RAS)在急性肺損傷中的作用引起了人們的廣泛關注。大量研究表明，RAS主要成分-AngⅡ及其受體活性與急性肺損傷的發生密切相關［1-3］。AngⅡ作為一種致炎因子可調控多種炎癥細胞因子如TNF-α、IL-1、IL-6及IL-8等在肺組織中表達，是引起急性肺損傷的重要原因之一。Ruiz-Ortega等［5］研究發現，ALI時多種炎癥細胞在肺內募集、活化，通過激活RAS產生大量AngⅡ。后者又可加劇肺部炎癥反應，從而形成惡性循環，最終導致肺組織損傷［6］。

研究證實，RAS在 VILI發病中也具有重要作用［7］。機械通氣可直接或間接激活RAS系統，使其效應物質AngⅡ表達增多。AngⅡ通過激活炎癥細胞產生一系列炎癥細胞因子，這些炎癥細胞和細胞因子相互作用，構成龐大而復雜的網絡體系，是引起肺生物傷的主要原因［5］。

在眾多的細胞因子中，TNF-α是炎癥反應中最主要的促炎因子，可介導急性肺損傷時中性粒細胞在肺部聚集和活化，并啟動炎癥反應級聯放大效應。研究表明［8］，在機械通氣肺損傷早期即可出現TNF-α高表達，提示TNF-α可能是引起炎癥反應的始動因素。然而，TNF-α表達是通過何種途徑來調控的目前尚不完全清楚。本實驗結果顯示，VILI組大鼠肺組織AngⅡ含量及TNF-α水平表達明顯高于對照組，而且TNF-α蛋白表達與AngⅡ含量呈正相關。說明AngⅡ作為肺部炎癥反應復雜網絡中的一個關鍵物質，對調控TNF-α表達有重要作用。

目前認為，AngⅡ介導肺部炎癥反應的主要受體是AT1受體［7］。動物實驗研究表明，在各種原因所致的急性肺損傷中，肺組織中 AngⅡ及其受體AT1的表達水平均顯著增高［3.9，10，］。因此我們推測，AngⅡ所介導的VILI發病過程有可能是通過AT1受體來實現的，因此，阻斷 AngⅡ與 AT1結合對防治VILI發生至關重要。

氯沙坦是一種二苯四咪唑類 AT1型受體拮抗劑，具有選擇性好，特異性高等特點，可特異性阻斷AngⅡ與AT1結合而發揮拮抗作用。研究表明，氯沙坦不僅具有抗炎作用，而且還有抗氧化和防止細胞凋亡等作用［10，11］。本實驗結果顯示，氯沙坦干預組大鼠肺組織AngⅡ含量與VILI組比較無明顯差異，但肺組織TNF-α蛋白表達水平、肺組織勻漿中MPO活性和肺W/D比值均較VILI組明顯降低，同時，肺組織病理損傷程度也較VILI組明顯減輕。說明氯沙坦可通過阻斷AngⅡ與AT1受體結合而抑制TNF-α的表達，減輕肺組織炎癥性損傷，對 VILI具有一定保護作用。

綜上所述，AngⅡ通過調控肺組織中TNF-α的表達在VILI發病中起著重要作用，氯沙坦可阻斷AngⅡ與AT1受體的結合，抑制 TNF-α的表達，對VILI具有一定防治作用，但AngⅡ通過何種信號轉導途徑來調控TNF-α表達尚有待深入研究。

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