烏司他丁聯合血必凈對內毒素致綿羊多臟器功能障礙綜合征的防治研究

牛廷獻，萬東君，王春雨，陸 璐，王紅義，羅曉紅

(蘭州軍區蘭州總醫院動物實驗科，蘭州 730050)

多臟器功能障礙綜合征 (multip le organ dysfunction syndrome，MODS)指在嚴重創傷、感染、休克等原發病發生24h后，同時或序貫出現2個或2個以上系統器官功能不全的綜合征。它具有發病急、進展快、病死率高的特點，是ICU患者最重要的死亡原因［1］。盡管近30年對其發病機制和防治研究進行了深入探索，但仍未獲得臨床滿意的防治效果。烏司他丁(ulinastain，UTI)是肝臟分泌的一種糖蛋白［2］，是典型的廣譜蛋白酶抑制劑，在早期可阻斷全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)向 MODS發展。血必凈(XUEBIJING，XBJ)具有拮抗內毒素(lipopolysaccharide，LPS)、抗炎、改善免疫功能、保護組織細胞的作用［3，4］。本研究利用 LPS建立綿羊MODS模型，并利用烏司他丁聯合血必凈對其防治效果進行研究，以探討 MODS的發病機制及防治措施。

1 材料和方法

1.1 動物與分組

50只杜泊綿羊(蘭州軍區蘭州總醫院動物實驗科提供，實驗動物使用許可證號：SYXK(軍)2009-022)，雌雄各半，體重(20±1.5)kg，隨機分為：對照組(A組)、模型組(B組)、烏司他丁組(C組)、血必凈組(D組)和烏司他丁+血必凈組(E組)，每組各10只。全價飼料飼養。

1.2 模型建立

實驗動物均用速眠新Ⅱ號(1.5m L/kg)(軍事醫學科學院軍事獸醫研究 長春，吉獸藥試字(2004) 005013)肌注麻醉后，LPS(血清型為：O127：B8，批號為64H4010，美國 Sigma公司)按6μg/kg于30m in內經前肢橈靜脈泵入。

1.3 防治方法

動物全麻后，在靜脈泵入LPS前1h，C組、D組和E組分別靜脈滴注UTI(3000U/kg)、XBJ(2m L/kg)和UTI+XBJ。之后，均1次/d，連續3d。同時，A組和B組靜脈滴注同劑量的生理鹽水。檢測指標采樣時，0h和3h時綿羊處于麻醉狀態，其余為清醒狀態。

1.4 檢測指標與方法

所有指標的檢測均由本院檢驗科完成。

1.4.1 血氣分析 LPS靜脈泵入后，各組分別于0h、1h、2h、3h和6h經股動脈采血，立即測定氧分壓(PaO2)。

1.4.2 血常規和血清生化指標的測定 各組分別于0h、3h、6h、12h、24h、48h和72h經頸靜脈采血，測定WBC數目和天門冬氨酸轉氨酶(AST)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、總膽紅素(TBIL)和肌酐(CRE)。

1.5 MODS的診斷標準

參照胡森等［7］提出的動物發生 MODS時各個器官功能障礙分期診斷標準和評分標準。在靜脈泵入LPS后出現2個或2個以上器官或系統功能障礙判定為MODS。

1.6 數據處理與統計

2 結果

2.1 體征表現及死亡率

B組綿羊靜脈泵入 LPS 2h后，出現呼吸頻率加快，心率快而不齊，3h后腹脹，尿頻，不能站立，運動障礙。E組較B、C和D組的體征表現明顯減輕，C、D組較 B組有所減輕，但不明顯。A組無明顯體征改變。24h后，B、C、D和 E組分別有6只、4只、5只和2只綿羊因呼吸窘迫、心律失常、血壓下降，繼之心衰死亡。A、B、C、D和E四組綿羊的死亡率分別為 0%、60%、40%、50%和20%。結果表明，烏司他丁聯合血必凈較其單獨應用能明顯改善LPS誘導的動物體征表現、降低死亡率。

2.2 血氣分析

靜脈泵入LPS后，B、C、D和E組1～3h動脈氧分壓(PaO2)(mmHg)與A組相比均明顯下降(P＜0.05或P＜0.01)，氧合指數［PaO2/FiO2(吸入氧濃度)］均(26.70kPa(1kPa=7.5mmHg)。E組與B、C和 D三組相比，只在6h時 PaO2明顯升高(P＜0.05)，其他時點雖升高，但組間相比均無統計學意義(P＞0.05)(見表1)。結果表明，靜脈泵入LPS后，B、C、D和E組1～3h的氧合指數已達到急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)的診斷標準［8］。早期應用烏司他丁聯合血必凈對肺功能有所改善。

表1 各組不同時點血氣比較Tab.1 The blood gas analysis in different time in each group

2.3 血清生化指標的變化

靜脈泵入LPS后結果表明：(1)AST：B、C、D和E組6h～72h的水平與A組相比明顯或顯著升高(P＜0.05或 P＜0.01)，24h時達到峰值。12h～72h，與B組相比，C組和E組的水平明顯下降(P＜0.05或P＜0.01)；與C組相比，D組在24h～72h時，其水平明顯升高(P＜0.05)，而E組則在48h～72h時明顯降低(P＜0.05)；與D組相比，在24h～72h時，E組的水平明顯下降(P＜0.05)。(2) ALT、TBIL和 CRE：三者的變化趨勢基本相同。在不同時點，B、C、D和E組三者的水平明顯高于A組(P＜0.05或P＜0.01)；B、C、D和E四組間的水平相比，C、E兩組較B、D組明顯下降(P＜0.05或P＜0.01)。C、E兩相比，E組較C組雖有所下降，但無統計學意義(P＞0.05)(見表 2)。以上結果表明，靜脈泵入LPS后成功地建立了MODS模型。單獨應用烏司他丁或二者聯合應用對內毒素誘導的多臟器損傷具有明顯的干預作用。

2.4 血常規變化

血常規結果表明(見圖1)，靜脈泵入 LPS后，B、C和D和E組3h～6h WBC數目與A組相比明顯下降(P＜0.01)，6h后開始上升，至24h后驟然升高。24h～72h，B、C和D和E四組WBC數目與A組相比明顯升高(P＜0.01)。48h～72h，B、C、D和E四組間WBC數目相比，E組較其他三組明顯降低(P＜0.01)，C組較 B組明顯降低(P＜0.05)，C組較D組WBC數目雖有所降低，但無統計學意義(P＞0.05)。結果表明，烏司他丁聯合血必凈盡管未能有效地干預內毒素誘導的MODS WBC數目驟然降低或升高，但對多臟器損傷的炎癥反應具有明顯的抑制作用。

圖1 不同時點各組WBC的變化Fig.1 The change of WBC in each group at different time

3 討論

MODS動物模型是研究MODS發病機制和臨床防治的基礎，同時也是研究的一個難點。MODS是多因素誘發的臨床綜合征，發病機制復雜，再加上治療因素的干擾，使得模擬MODS的病理和臨床特征變化十分困難。因此，建立簡單且符合臨床實際的MODS動物模型一直是國內外學者探索的課題。內毒素介導的MODS模型具有致傷因素單一、造模方法簡便快捷、結果便于分析等優點。大鼠、兔、綿羊和犬等動物均可用于建立 MODS模型［9-12］，但不同動物對LPS敏感性不同，而綿羊是復制MODS模型較為理想的動物，在小劑量LPS作用下就能形成SIRS，繼而誘發 MODS［13］。另一方面，綿羊為大型動物，便于實驗觀察血流動力學、氧代謝和肺機械力學的改變，而且其病理生理變化與人相近［14］。因此，本研究選擇靜脈泵入小劑量 LPS建立綿羊MODS模型。

UTI是于1909年由Beuer和Reich在人尿液中發現，在脂多糖誘導的炎性反應中，UTI通過調節細胞炎性因子以保護器官免受損傷［15］。1985年正式應用于臨床［16］。主要用于治療急性胰腺炎、急性肺損傷、ARDS、SIRS以及減輕圍術期臟器功能的損傷等［17］。它是一種單鏈多肽糖蛋白，具有廣譜的酶抑制作用，既能抑制胰蛋白酶、透明質酸酶、彈力蛋白酶、緩激肽等多種蛋白分解酶，又能有效抑制磷脂酶，還能穩定細胞膜和溶酶體膜，清除氧自由基，減少炎癥因子的釋放和具有免疫調節作用。血必凈注射液屬國家中藥保密品種，其有效成分提取自紅花、赤芍、川芎、丹參、當歸中，包括紅花黃色素A、川芎嗪、丹參素、阿魏酸、芍藥苷、原兒茶醛等，由我國中西醫結合急救醫學奠基人王今達教授根據“三證三法”辨證原則及“菌毒并治”理論［18］，以王清任血府逐瘀湯組方為基礎研制的靜脈制劑，具有活血化瘀、扶正固本、清熱解毒、菌毒并治等功效。在各臟器損傷的治療中發揮了拮抗內毒素、清除氧自由基［19-21］、保護血管內皮［22，23］、抗炎性介質［24-27］、調節免疫功能［28，29］等作用。血必凈通過抑制中性粒細胞在肺內集聚、過度活化、呼吸爆發，減少氧自由基，從而急性肺損傷起到了一定的保護作用。同時，它能夠有效改善慢性肺心病心功能不全患者的血液流變性，提高 PaO2、降低PaCO2，改善呼吸狀態，改善心臟收縮功能［30］。本研究正是基于二者的上述作用將其聯合應用對LPS誘導的MODS進行防治研究。

本研究靜脈泵入LPS后，從模型組綿羊的體征表現、死亡率、PaO2及血清生化指標和WBC數目明顯改變的結果表明，成功地建立了綿羊 MODS模型。同時表明，烏司他丁聯合血必凈較其單獨應用能明顯改善LPS誘導的動物體征表現、降低死亡率、早期應用對肺功能有所改善。血清生化指標結果表明，單獨應用烏司他丁及其聯合血必凈，在不同時點均能明顯降低AST、ALT、TBIL和CRE的水平(P＜0.05)，而血必凈未能明顯降低這四者的水平。表明烏司他丁能有效地拮抗內毒素，防治肺、肝、腎等臟器的損傷。至于單獨應用血必凈為何未能達到明顯的干預效果?可能是其應用劑量及時機不妥，這有待進一步的研究。

血常規變化趨勢表明，靜脈泵入LPS后，WBC數呈“勺型”波動變化，B、C、D和E四組3h～6h均明顯下降(P＜0.01)，6h后開始上升，至24h后驟然升高(P＜0.05或P＜0.01)，這與有關文獻報道一致［31，32］。這可能是LPS對WBC具有急劇殺傷作用或抑制WBC的增殖，使得WBC數目在短時間內明顯下降。之后形成的SIRS又使得WBC數目急劇升高。同時，48h～72h這四組組間 WBC數目相比，烏司他丁聯合血必凈組(E組)較其他三組明顯降低(P＜0.01)。可能是二者通過抑制炎癥反應的程度，減少了應激性WBC升高，進而減輕了LPS造成的損傷。

本研究結果表明，二者聯合應用能減輕內毒素所致的綿羊MODS的肺、肝、腎等臟器的損傷，減輕內毒素繼發的全身炎癥反應，早期應用有助于降低MODS的病死率，但血必凈的劑量及給予時機有待進一步研究。

［1］Marshall，JC.SIRS and MODS：What is their relevance to the science and pratice of intensive care［J］.Shock，2000，14(6)：586-589.

［2］Watanabe T，Sato Y，Ichida T，et al.Comparison of urinary ulinastatin levels between donors and recipients immediately following adult living related donor liver transp lantation［J］.Transplant proceedings，2003，35(1)：76-77.

［3］張畔，曹書華，崔克亮，等.血必凈對多臟器功能障礙綜合征單核細胞 HLA-DR表達影響的研究［J］.中國中西醫結合急救雜志，2002，9(1)：21-23.

［4］曹書華，王今達.血必凈對感染性多器官功能障礙綜合征大鼠組織及內皮損傷保護作用的研究［J］.中國危重病急救醫學，2002，14(8)：489-491.

［5］郭鳳梅，邱海波，周韶霞，等.急性呼吸窘迫綜合征綿羊模型的建立［J］.中國危重病急救醫學，2001，13(2)：95-98.

［6］王春雨，凡春玲，，羅曉紅，等.內毒素致多臟器功能障礙綜合征綿羊模型的研究［J］.中國比較醫學雜志，2011，21(8)：49 -52.

［7］胡森，盛志勇，周寶桐，等.雙相遲發多器官功能不全綜合征(MODS)動物模型的研究［J］.中華創傷雜志，1996，12(2)：102-106.

［8］Beruard G R，Artigas A，Brigham K L，et al.The American-European Consensus Conference on ARDS： definitions，mechanism，relevant，outcomes，and clinical trial coordination［J］.Am J Respir Crit Care Med，1994，149(3pt1)：818-824.

［9］段紹斌，李學雄，姚華，等.多器官功能障礙綜合征時血管內皮細胞損傷的研究［J］.新疆醫科大學學報，2010，33(3)：271-274.

［10］盧瑗瑗，尹文，虎曉岷.家兔失血性休克并內毒素誘發多器官功能障礙綜合征模型制備［J］.江蘇醫藥，2005，31(6)：448-450.

［11］任添華，牛馳，任愛民，等.MODS動物模型組織氧代謝的變化特征［J］.首都醫科大學學報，2008，29(3)：308-310.

［12］Nolan B，Collette H，Baker S，et al.Inhibition of neutrophil apoptosis after severe trauma is NF kappabeta dependent［J］.Traum，2000，48(4)：599-605.

［13］胡森，盛志勇，周寶桐.MODS動物模型研究進展［J］.中國危重病急救醫學，1999，11(8)：504-507.

［14］Mustered RA，Fisher J，Hayman S，et al.Cardiopulmonary response to pseudomon as septicemia in swine：an improved model of the adultre spiratory distress syndrome［J］.Lab Animal Sci，1989，39(1)：37-43.

［15］Innoue K，Takan H，Shimada A，et al.Urinary trypsin inhibitor protects-against systemic inflammation induced by lipopolysaccharide［J］.Mol pharmaeol，2005，67(3)：673-680.

［16］Mutsumi M，Mizobuchi S，Kaku，R，et al.Changes of urinary tripsin inhibitor in blood and urine，as well as serum cytokines in living related liver transplantation［J］.Masui，2003，52(3)：251-256.

［17］Inoue K，Takano H，Yanagisawa R，et al.Antioxidative role of urinary trypsin inhibitor in acute lung injury inducing by lipopolysaccharide［J］.Int J Moi Med，2005，16(6)：1029-1033.

［18］曹書華，王今達，李銀平.從“菌毒并治”到“四證四法”-關于中西醫結合治療多器官功能障礙綜合征辨證思路的深入與完善［J］.中國危重病急救醫學，2005，17(11)：641-643.

［19］馬巍，楊季紅，馬靜，等.血必凈對大鼠肝缺血-再灌注后急性肺損傷的保護作用［J］.河北醫藥，2008，30(2)：142-143.

［20］馬俊清，路偉，黃楊，等。血必凈注射液對百草枯刺激的大鼠肺微血管內皮細胞損傷的保護作用［J］.中國急救醫學，2008，28(9)：808-812.

［21］林福清，鄧小明，朱科明.“血必凈”注射液對急性炎癥反應綜合征患者中性粒細胞功能的影響［J］.同濟大學學報(醫學版)，2007，28(6)：86-89.

［22］張淑文，孫成棟，文燕，等.血必凈注射液對膿毒癥大鼠血清內毒素及脾臟特異性免疫功能的影響［J］.中國中西醫結合急救雜志，2007，14(2)：91-94.

［23］曹書華，王今達.血必凈對感染性多器官功能障礙綜合征大鼠組織及內皮損傷保護作用的研究［J］.中國危重病急救醫學，2002，14(8)：489-491.

［24］王強，姚詠明，王文江，等.血必凈注射液對燙傷大鼠肺組織高遷移率族蛋白B1表達的影響及意義［J］.解放軍醫學雜志，2007，32(4)：374-376.

［25］劉達興，盧斌，梁貴友，等.靜脈滴注血必凈對體外循環肺損傷的保護作用研究［J］.中國藥房，2008，19(24)：1860-1862.

［26］張云杰.血必凈注射液對小腸缺血再灌注大鼠血清細胞因子的影響［J］.山東中醫藥大學學報，2008，32(6)：502-505.

［27］袁雪松，卞曉星，戚傳平.血必凈對大鼠外傷性腦損傷后血清S-100β和IL-6水平的影響［J］.江蘇大學學報(醫學版)，2009，19(1)：35-38.

［28］孫軍平，汪建新，郭麗娜，等.內毒素致兔急性肺損傷及血必凈保護作用［J］.軍醫進修學院學報，2009，30(1)：102-104.

［29］高紅梅，常文秀，曹書華.“血必凈”注射液對內毒素刺激的內皮細胞的影響［J］.中國急救醫學，2005，25(6)：437-438.

［30］孫正達，沈建明，沈蕾 血必凈注射液改善膿毒癥大鼠心臟功能的作用［J］.復旦大學學報(醫學版)，2008，35(2)：208-211.

［31］任添華，姜悅，任愛民，等.單相速發型多臟器功能障礙綜合征動物模型的研究［J］.首都醫科大學學報，2005，26(4)：479 -481.

［32］平易，劉駿峰，謝瓊紅，等.內毒素介導的多臟器功能障礙綜合癥動物模型的研究［J］.中國臨床醫學，2009，16(2)：287 -290.