大黃魚Hepcidin基因轉錄物的相對定量分析

蔡 靈， 吳曼麗， 范丹青， 楊 明

(1.廈門大學近海海洋國家重點實驗室，福建廈門361005;2.上海大學環境與化學工程學院，上海200444)

實時熒光定量PCR方法(real-time quantitative PCR)是指在PCR指數擴增期間，通過連續監測熒光信號強弱的變化來即時測定特異性產物的量，并根據標準曲線定量未知模板的方法.該方法具有準確、靈敏和簡便等特點，在微生物檢測、轉基因食品檢測和基因表達研究等方面具有重要的應用價值［1］.實時定量PCR方法分為以檢測目的基因自身含量的絕對定量和以內參基因為參比進行的相對定量兩類.相對定量根據參照基因和目的基因的擴增效率是否接近，又分為雙標準曲線相對定量法和比較Ct(cycle threshold)相對定量法.在這兩個相對定量法中，當目的基因和參照基因的擴增效率接近時，比較Ct相對定量法是公認的得到實驗結果更為快捷和方便的方法［2］.因此，選擇合適的內參基因，設計合適的引物，建立合適的PCR反應條件是實時定量PCR方法建立的重要環節［3］.

持家基因(house-keeping gene)又稱管家基因，是指所有細胞中均要表達的一類基因.超過90%的研究者使用3-磷酸甘油醛脫氫酶，β-actin，18S rRNA和28S rRNA作為參照基因進行定量［4］.由于這些基因在個體各個生長階段的大多數，或幾乎全部組織中持續表達或變化很小，因此，其表達水平受環境因素的影響較小，只受啟動序列或啟動子與RNA聚合酶相互作用的影響，而不受其他機制的調節.上述管家基因可作為實時熒光定量的內參基因，通過校正轉錄效率和起始模板的用量，使不同樣本目的基因的比較成為可能［5-6］.

大黃魚(Pseudosciaena crocea)是我國沿海重要的經濟魚類，但因酷漁濫捕，現今漁汛消失，野生大黃魚瀕臨絕跡.目前市售的大黃魚均以人工養殖為主，但由于其在養殖過程中較易受病害影響，因而導致養殖風險和成本較高，市售價格昂貴.開展大黃魚體內免疫功能相關基因的研究，對人工養殖大黃魚的病害防治具有重要的理論意義和廣闊的應用前景.本研究克隆了內參基因的序列，建立了大黃魚抗菌肽Hepcidin基因(pc-hepc)的實時相對定量分析方法，完成了大黃魚免疫器官中Hepcidin基因轉錄物的相對定量分析.該工作不僅為開展Hepcidin抗菌肽基因表達特性等的研究奠定了基礎，而且為開展其他魚類中免疫相關基因體內表達機制的研究提供了參照.

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

大黃魚取自福建福州羅源灣養殖場，平均體重為40 g.

脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，Sigma公司; Trizol試劑盒，Invitrogen公司;PrimeScriptTMRT Reagent Kit反轉錄試劑盒、TaKaRa PMDT-18質粒連接試劑盒、DNA Marker，大連寶生物公司;Qiaquick Gel Extraction Kit，QIAGEN公司;Power SYBR Green PCR Master Mix熒光定量試劑，Applied Biosystem公司;DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitⅠ，Roche公司;所有引物由上海生物工程有限公司合成;其他試劑均為國產分析純.

1.2 實驗方法

1.2.1 組織樣本采集及其RNA提取

攻毒組(A組)大黃魚腹腔注射800 μg LPS，對照組(B組)注射等體積生理鹽水，48 h后采集樣品(樣品數量n=3).現場解剖，取頭腎組織樣品迅速放入液氮中，-80℃冰箱保存.使用Trizol試劑盒抽提RNA.核酸蛋白含量測定儀(GE公司)檢測RNA的濃度和質量.

1.2.2 內參基因(18S rRNA和β-actin)序列的獲得

根據GenBank中黑鯛Hepcidin基因的序列設計18S rRNA和β-actin基因的引物，如表1所示.使用PrimeScriptTMRT Reagent Kit進行反轉錄，并在PTC-200型PCR儀(MJ Research公司)上進行PCR擴增.PCR反應條件為：94℃變性3 min;隨后進行30個循環的94℃變性30 s，55℃退火40 s和72℃延伸1 min;最后，72℃延伸 5 min.PCR產物經Qiaquick Gel Extraction Kit回收純化后，使用TaKaRa PMDT-18載體連接試劑盒連接轉化，并由上海生工生物工程公司測序.

表1 用于序列擴增和實時定量PCR的引物Table 1 Primers for sequence amplifications and real-time PCR

1.2.3 實時熒光定量RT-PCR

取500 ng大黃魚頭腎RNA進行反轉錄.經優化PCR條件后，按1 ng RNA轉錄為1 ng cDNA計算，取2 ng稀釋后的反轉錄產物加入20 μL反應體系中，同時加入濃度為10 μM的上、下游引物各1 μL.使用Power SYBR Green PCR Master Mix試劑進行實時熒光定量PCR.PCR反應條件為：60℃ 2 min，95℃ 10 min;隨后進行40個循環的95℃ 15 s，60℃ 1 min，并在60℃采集熒光信號.PCR程序結束后，對PCR反應產物進行溶解曲線的測定，反應程序為：95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃15 s.

1.2.4 Northern-blot實驗

采用 DIG HighPrimeDNA Labelingand Detection Starter KitⅠ試劑盒標記Hepcidin探針.等量混合A組和B組各3條魚的頭腎RNA，并取40 μg總RNA進行甲醛變性凝膠電泳，按試劑盒說明書進行Northern-blot實驗.掃描Northern-blot實驗結果，并使用Bio-Rad公司的Quantity One軟件對Northern-blot結果圖中的條帶進行光強度分析，以確定各條帶的光強度及其占總光強度的比例.

1.2.5 數據統計與分析

以50 ng cDNA為起始量進行10倍梯度稀釋，獲得擴增效率標準曲線.擴增效率標準曲線使用Origin 7.0軟件繪制，橫坐標為稀釋倍數的lg值，縱坐標為熒光定量分析的Ct值.

使用比較Ct法分析實時熒光定量PCR數據時，要求內參基因和目標基因的擴增效率一致.當滿足上述條件時，取一個樣品的熒光值，用ΔCt(即目標基因與內參基因Ct值的差值)進行標準化.比較不同的樣品相對量時，用標準化后的值，即不同樣品的ΔCt的差值進行比較，即Δ(ΔCt)=ΔCt1-ΔCt2.最后，當轉化成RNA水平實際變化倍數時，結果為Y= 2-Δ(ΔCt)［4］.本實驗的相對定量數據以18S rRNA基因片段為內參，采用B組第一條魚的Hepcidin表達量進行數據歸一化，采用2-Δ(ΔCt)方法進行計算.

2 實驗結果

2.1 大黃魚頭腎總RNA的提取

紫外分光光度計測定總RNA的吸光值A260/A280在1.8～2.0之間，證明了所提取的RNA純度較高，無蛋白和DNA污染.取微量總RNA提取液進行1%瓊脂糖凝膠電泳，結果顯示，rRNA具有完整帶型，證明提取的RNA較完整，無降解.

2.2 大黃魚18S rRNA和β-actin片段的cDNA序列及序列的同源性分析

經過序列相似性比對分析，本實驗首次擴增出了大黃魚的18S rRNA和β-actin的cDNA序列片段，并已登錄GenBank獲得了登錄號，結果如表2所示.

表2 大黃魚18S rRNA和β-actin片段的序列相似性分析Table 2 Similarity analysis of 18S rRNA and β-actin fragments

2.3 大黃魚3種基因的擴增和溶解曲線

圖1為多次重復的實時熒光定量PCR產物溶解曲線圖，其中凝膠電泳圖代表普通PCR擴增產物，溶解曲線圖代表實時熒光定量PCR擴增產物; M1為 100 bp ladder DNA Marker，M2為 DL2000 DNA Marker.可以看出，利用所設計的引物擴增出的Hepcidin，18S rRNA和β-actin等目的基因片段，都具有各自單一的溶解溫度，分別為80，78和84℃; PCR反應產物特異，并且瓊脂糖凝膠電泳也證明了其PCR產物單一，沒有二聚體的產生.

2.4 實時熒光相對定量 PCR方法檢測大黃魚Hepcidin基因方法的建立

2.4.1 擴增效率標準曲線

圖2為大黃魚3種基因實時熒光定量PCR的擴增效率標準曲線，其中x為模板基因的稀釋倍數.由圖2(a)可見，18S rRNA基因擴增曲線的斜率與Hepcidin基因斜率相差(Δk)僅為0.08，線性回歸系數差值(ΔR2)小于0.005，符合比較Ct法分析的要求.在圖2(b)中，β-actin基因擴增曲線的斜率與Hepcidin基因斜率差為0.22，ΔR2也小于0.005.比較而言，18S rRNA更接近Hepcidin基因的擴增效率，因此，更適合用于比較Ct法分析的實時定量PCR.

2.4.2 與Norther-blot結果的比較

為了驗證大黃魚內參基因18S rRNA用于實時熒光定量方法的可行性和有效性，將PCR的實驗結果與Northern-blot的實驗結果進行了比較，結果如圖3所示，其中A為對照組樣品，B為攻毒組樣品，M為RNA Marker 1000.結果表明，利用實時熒光定量PCR方法分析，攻毒組大黃魚經LPS誘導，頭腎中的Hepcidin基因被誘導并升高至對照組的1.80倍;而利用Northern-blot方法分析，攻毒組大黃魚頭腎中的Hepcidin基因被誘導至對照組的2.11倍，證明兩種方法所得的結果基本一致.

圖1 普通PCR擴增產物電泳圖和實時熒光定量PCR產物溶解曲線Fig.1 Agrose gel analysis and melting curve anlaysis of the PCR products

圖2 大黃魚3種基因實時熒光定量PCR的擴增效率標準曲線Fig.2 Relative standard curves of the hepcidin，18S rRNA and β-actin genes from the large yellow croaker using real-time PCR

圖3 Hepcidin基因實時熒光定量 PCR結果與Northern-blot結果比對Fig.3 Comparison ofthe hepcidin gene quantity obtained from real-time PCR and Northern-blot

3 討論

本研究建立了大黃魚Hepcidin抗菌肽基因實時熒光相對定量分析方法，與傳統的Northern-blot半定量基因表達方法相比，本方法利用了內參基因進行校正，使結果更加準確可靠.由于Northern-blot實驗直接操作RNA進行電泳，而RNA又極易在實驗中降解，因此，對實驗者的實驗技能和對實驗過程的控制要求較嚴格.同時，Northern-blot的每個樣品的RNA用量，如本實驗中的40 μg總RNA上樣量，遠大于熒光定量PCR的500 ng總RNA初始量.因此，在操作大量基因的表達檢測時，實時熒光定量PCR相比傳統的Northern-blot方法，優勢非常明顯.

抗菌肽Hepcidin是一種重要的先天性免疫因子，于2000年由Krause從人類血漿中分離出來.由于抗菌肽在肝臟表達，因此，被命名為Hepcidin或LEAP-1(liver expressed antimicrobial peptide)［7］.隨后，在小鼠、豬、狗等多個哺乳動物物種中均發現了這一抗菌肽的存在［8-10］.2002年，Shike等［11］在細菌誘導的雜交斑紋鱸魚(Morone saxatilis×Morone chrysops)鰓中發現了魚類中的第一個Hepcidin抗菌肽.此后，在大西洋鱈魚(Gadus morhua)［12］、花鱸(Lateolabrax japonicus)［13］、 黑 鯛 (Sparus macrocephlus)［14-16］等多種魚類中也發現了這一抗菌肽的存在.Hepcidin家族的抗菌肽是一種保守的富含半胱氨酸，具有二硫鍵結構的抗菌肽.研究表明，Hepcidin抗菌肽在人體等哺乳動物中是一種調節體內鐵穩態的關鍵物質和一種極為重要的鐵代謝調激素［7-10］.在魚類中，Hepcidin抗菌肽在先天免疫相關方面發揮著更為廣泛的作用.魚類體內存在多個Hepcidin抗菌肽變體，細菌、致炎物質等均可影響Hepcidin在魚體內各器官組織中的表達合成［16］.研究發現，Hepcidin的不同變體不僅可以誘發免疫相關基因的表達合成，同時具有抑制腫瘤細胞的活性，并在病毒感染細胞后起到保護細胞抵抗病毒侵染的作用［17-18］.這些研究進一步證實了Hepcidin抗菌肽對魚類先天免疫作用的重要性.

4 結束語

開展大黃魚體內Hepcidin基因的研究，利用本實驗建立的實時熒光定量分析方法對其基因進行定量檢測，可以更加深入地了解大黃魚抗菌肽的表達情況，為進一步開展大黃魚的先天免疫機制研究奠定了基礎.Hepcidin抗菌肽在大黃魚中的研究不僅對減少大黃魚養殖病害有所助益，同時也對其他養殖魚類的病害防治具有普遍的意義.

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