蘇丹草種子醇溶蛋白提取和電泳條件優化

鄧志瑞， 孫晶晶， 張文舉， 陳 沁

(上海大學生命科學學院，上海200444)

蘇丹草(Sorghum sudanense)原產于非洲北部的蘇丹高原，在歐洲、北美洲及亞洲大陸的熱帶和亞熱帶均有栽培，是世界各國栽培最普遍的一年生禾本科牧草之一，被稱為禾本科牧草中的“牧草之王”［1］.由于種子質量管理技術和相關制度的缺失，我國蘇丹草種子生產上的種質非常混亂，因此，對蘇丹草品種真實性和純度進行鑒定十分重要［2］.種子醇溶蛋白是種子胚乳中的主要貯藏蛋白質，該蛋白質不受種植環境等的影響，是植物基因類型的表現特征之一［3］，其指紋研究在品種真實性和資源鑒定評價中具有重要的應用價值［4］.許多學者已經將醇溶蛋白分析技術廣泛應用于植物種類鑒別、基因標記、種子純度檢驗、遠緣雜種鑒定、體細胞無性變異鑒定等方面［5-8］.醇溶蛋白電泳圖譜不僅可以表現植物種間的差異，也可表現種內類型的差異.建立每種植物的醇溶蛋白指紋圖譜，可以為植物資源的廣泛利用提供實驗和理論依據［9-10］.本實驗通過研究影響醇溶蛋白提取和SDS-PAGE電泳效果的主要因素，優化了蘇丹草種子醇溶蛋白提取和SDS-PAGE電泳條件，為蘇丹草種子分子水平的鑒定奠定了研究基礎.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗所用的蘇丹草(Sorghum sudanense)產自湖南，高粱(Sorghum bicolor)產自河北泊頭，玉米(Zea may)產自美國，大麥(Hordeum vulgare)產自加拿大.

1.2 實驗方法

1.2.1 不同提取劑對蘇丹草醇溶蛋白提取的影響

用液氮研磨蘇丹草種子至粉末狀，稱取100 mg轉移到1.5 mL Eppendorf管中，分別加入600 μL 70%乙醇、70%正丙醇、70%異丁醇、70%異丙醇、70%叔丁醇和70%乙二醇，振蕩混勻后，37℃水浴提取過夜.然后，8 000 r/min離心15 min，采用考馬斯亮藍G-250方法測定上清液蛋白濃度.把蛋白質濃度稀釋至12 μg/μL，取5 μL蛋白溶液加入等體積的2×電泳上樣緩沖液，95℃處理5 min后上樣，以12%的分離膠進行電泳檢測［11-16］.

1.2.2 樣品/提取劑比例對蘇丹草種子醇溶蛋白提取的影響

分別按種子粉末質量與提取劑體積比(g/mL)為1∶2，1∶4，1∶6，1∶8，1∶10，1∶12，1∶15，1∶20加入提取劑提取醇溶蛋白，以12%的分離膠進行電泳檢測.

1.2.3 還原劑DTT的濃度對蘇丹草種子醇溶蛋白提取的影響

配制含不同終濃度DTT(0%，0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%，1.0%，1.5%，3.0%)的70%正丙醇提取劑，以12%的分離膠進行電泳檢測.

1.2.4 不同上樣量、不同分離膠濃度對電泳的影響

分別使用8%，10%，12%，15%的分離膠，以上述最佳提取條件下得到的蘇丹草種子醇溶蛋白為樣品，稀釋，使得不同上樣孔在相同上樣體積(10 μL)中含有的醇溶蛋白分別為10，20，30，35，40，50，60，70 μg.

1.2.5 優化條件對其他禾本科種子醇溶蛋白分析的可行性研究

根據上述實驗得到的蘇丹草種子醇溶蛋白提取和電泳優化條件，對幾種常見的禾本科種子醇溶蛋白進行提取和電泳分析，檢驗所建立的優化條件是否適用于其他禾本科種子.

2 結果與分析

2.1 不同提取劑對蘇丹草種子醇溶蛋白提取的影響

用不同提取劑提取的醇溶蛋白電泳圖譜如圖1所示，其中1為標準蛋白，2～7為分別用70%乙醇、70%正丙醇、70%異丁醇、70%異丙醇、70%叔丁醇和70%乙二醇提取的醇溶蛋白.可見，使用不同提取劑得到的醇溶蛋白電泳圖譜存在差異，主要表現在譜帶豐富度和帶型不同，其中以乙醇、正丙醇和叔丁醇提取得到的電泳圖譜豐富度最好，而用乙二醇和異丁醇只能得到少量的譜帶.因此，本實驗選擇70%正丙醇作為蘇丹草種子醇溶蛋白的提取劑.

圖1 不同提取劑對蘇丹草醇溶蛋白提取的影響Fig.1 Effects of different extracting agents on prolamin extraction from Sorghum sudanense seeds

2.2 樣品/提取劑比例對蘇丹草種子醇溶蛋白提取的影響

提取劑用量不同對提取蘇丹草種子醇溶蛋白有明顯影響(見圖2，其中1為標準蛋白，2～9分別為樣品/提取劑比例為1∶2，1∶4，1∶6，1∶8，1∶10，1∶12， 1∶15，1∶20所提取的醇溶蛋白圖譜).由圖2可見，條帶的強度隨提取劑用量的增加而減弱，其中以1∶4～1∶8提取的醇溶蛋白具有豐富的譜帶，而以1∶12和1∶15提取的蛋白譜帶清晰度明顯下降，當以1∶20提取時幾乎看不到蛋白譜帶.

圖3為不同提取劑用量，相同蛋白含量對蘇丹草種子醇溶蛋白提取的影響，其中1為標準蛋白; 2～9分別為樣品/提取劑比例為1∶2，1∶4，1∶6，1∶8，1∶10，1∶12，1∶15，1∶20所提取的醇溶蛋白，調整使得每孔上樣等量蛋白質(15 μg/加樣孔).可見，取相同質量的醇溶蛋白為上樣量，提取劑的比例越大，得到的圖譜條帶越豐富，提取效果越好.考慮到電泳圖的清晰程度，蛋白濃度測定的結果，以及實驗的操作性，本實驗選擇1∶8作為最佳提取劑比例.

圖2 不同提取劑用量(蛋白含量不同)對蘇丹草種子醇溶蛋白提取的影響Fig.2 Effects of different reagent dosages(different prolamin quality)on prolamin extraction from Sorghum sudanense seeds

圖3 不同提取劑用量(蛋白含量相同)對蘇丹草種子醇溶蛋白提取的影響Fig.3 Effects of different reagent dosages(same prolamin quality)on prolamin extraction from Sorghum sudanense seeds

2.3 還原劑DTT濃度對蘇丹草種子醇溶蛋白提取的影響

用含有不同濃度DTT的70%正丙醇作為提取劑，提取到的醇溶蛋白電泳圖譜如圖4所示，其中1為標準蛋白，2～10分別為加入還原劑DTT濃度為0%，0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%，1.0%，1.5%，3.0%的70%正丙醇.由圖可知，DTT可以提高醇溶蛋白的提取效率，且隨著DTT濃度的升高，提取效率也相應地提高.但當DTT濃度超過0.2%后，已沒有顯著劑量關系.考慮到成本的因素，本實驗選取0.2%DTT濃度的70%正丙醇作為最佳提取劑.

圖4 DTT濃度對蘇丹草種子醇溶蛋白提取的影響Fig.4 Effects of different reduction reagent concentrations on prolamin extraction from Sorghum sudanense seeds

2.4 上樣量、分離膠濃度對蘇丹草醇溶蛋白電泳的影響

隨著分離膠濃度的提高，醇溶蛋白的譜帶清晰度逐漸提高，并且不同濃度的分離膠得到的電泳條帶的數目也不相同(見圖5，其中1為標準蛋白;2～9分別為上樣孔醇溶蛋白量為10，20，30，35，40，50，60，70 μg的蛋白圖譜).同一分離膠，在一定的濃度范圍內，隨著上樣蛋白含量的增多，電泳條帶也逐漸清晰.但當醇溶蛋白的上樣蛋白量達到一定程度時，蛋白條帶開始堆積，譜帶的清晰度也開始下降，以至于難以區分.由圖5可知，12%或者15%的分離膠可以產生較好的分辨率，但當凝膠濃度高于15%時，膠片韌性較差，容易碎裂，因此，本實驗選取12%作為最佳分離膠濃度.在本實驗所用電泳條件下(膠板大小為73 mm×83 mm，膠厚度為0.75 mm，共15個上樣孔)，每孔最佳上樣量為40 μg.

圖5 上樣量、分離膠濃度對電泳結果的影響Fig.5 Effects of prolamin amount per well volume and separation gel concentration on SDS-PAGE

2.5 優化條件對其他禾本科種子醇溶蛋白分析的可行性研究

取分離膠濃度為12%，大麥、玉米、蘇丹草、高粱種子醇溶蛋白的上樣量為每孔40 μg，進行電泳檢測，結果如圖6所示，其中1為標準蛋白，2～5分別為所提取的大麥、玉米、蘇丹草、高粱的醇溶蛋白.可見，在該實驗條件下，幾種禾本科種子醇溶蛋白電泳圖譜的譜帶清晰，說明本實驗所建立的條件不僅可以用于蘇丹草醇溶蛋白的研究，也可以用于其他禾本科植物.

3 討論

一般來說，醇類的極性隨著碳鏈的增長而降低，但因為一個分子內羥基上的氧可以和另外一個分子上的氫形成氫鍵，所以容易造成極性的增加.種子醇溶蛋白提取劑的選擇早期以乙醇為主，后來漸漸轉變為正丙醇和叔丁醇［17］.本實驗除了選擇上述3種試劑外，還同時研究了另外3種醇類試劑對蘇丹草種子醇溶蛋白提取的影響.結果表明，不同的醇類試劑具有不同的提取效果，其中效果較好的是正丙醇、叔丁醇，這可能是由于組成蘇丹草種子醇溶蛋白的氨基酸殘基疏水性較強，相對于極性稍大的乙二醇和異丙醇，極性較弱的正丙醇和叔丁醇更有利于蘇丹草種子醇溶蛋白的提取.

圖6 幾種禾本科種子醇溶蛋白電泳圖Fig.6 Electrophoresis of prolamins of several common gramineae seeds

提取劑用量是影響醇溶蛋白提取的主要因素之一［14］.司學芝等［15］在研究麥醇溶蛋白和谷蛋白的提取條件時，選擇固液比在1∶6～1∶30之間.結果表明，隨著提取劑的增加，提取的醇溶蛋白總量增高，但隨后出現下降，說明提取劑的用量并非越多越好.本實驗的結果也表明，隨著提取劑的加入，提取到的醇溶蛋白總量增加，但提取效率呈現先上升后下降的趨勢.綜合考慮蛋白含量和濃度對SDS-PAGE條帶的影響，最終選擇固液比為1∶8.

研究表明，高粱屬種子醇溶蛋白中含有較高水平的半胱氨酸殘基和巰基［7，18］.因此，還原劑的加入可增加醇溶蛋白的提取量，同時提高蛋白的多態性.DTT可用于蛋白質中二硫鍵的還原，阻止蛋白質中半胱氨酸之間形成的分子內或分子間二硫鍵.由本實驗結果可知，加入DTT后譜帶顏色加深，說明蘇丹草種子醇溶蛋白的提取量變大.

傳統的SDS-PAGE分離蛋白的方法較成熟，凝膠韌性好，易于剝離，電泳圖譜較清晰［2，12］.本實驗結果表明，分離膠濃度對電泳圖譜的影響較大.隨著分離膠濃度的升高，醇溶蛋白特征譜帶的清晰度也相應提高.12%和15%范圍的凝膠可以得到比較清晰的電泳譜帶，但在譜帶的帶型以及凝膠的后處理方面，12%的凝膠較好.根據蘇丹草醇溶蛋白分子量大小，相對于8%濃度的分離膠，10%的凝膠譜帶更加清晰可辨.10%凝膠的電泳時間雖短，但膠的牢固程度較低，易破裂;15%的凝膠的分辨效率較好，凝膠的質量也較好，但成膠的時間較長，實驗時間跨度大.比較發現，可以根據不同的實驗目的采用不同的分離膠濃度，如為了快速鑒定可采用10%的分離膠，若要準確分辨特征譜帶可采用12%的分離膠.

醇溶蛋白的上樣量也會影響電泳檢測蛋白的結果.當蛋白量較小時，蛋白質各組分含量少，所結合的考馬斯亮藍少，著色淺，效果不好;相反，過高的上樣量會使蛋白質含量過高，電泳條帶顏色變深、帶型變寬，相近的條帶會出現重疊，不便識別.本實驗結果表明，蘇丹草醇溶蛋白的上樣量以40 μg時合適.

本實驗中的禾本科醇溶蛋白圖譜表明，通過蘇丹草種子優化的醇溶蛋白提取和電泳條件是可以應用于其他幾種禾本科植物的，并可得到良好的分離效果.

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