Cupriavidus metallidurans CH34中2個苯酚降解基因簇的篩選與功能鑒定

李 莉， 張俊亞， 唐遠平， 宋任濤， 朱晨光

(上海大學生命科學學院上海市能源作物育種及應用重點實驗室，上海200444)

苯酚是焦化廠及煉油廠污水的主要有機污染物.近30年的研究表明，許多微生物參與此類有機物的降解過程［1］，苯酚的生物降解已成為一種經濟高效且不會產生二次污染的方法［2］.降酚微生物基因組中存在多個與降酚相關的基因，組合形成操作元，一起調控微生物降解苯酚.目前，苯酚的好氧降解途徑已被解析，步驟如下：苯酚加氧變為鄰苯二酚，再分別由鄰位或間位途徑環裂解，鄰位途徑產生β-一酮基己二酸中間產物，間位途徑產生α-一酮基己二酸中間物，兩種路徑都形成丙酮酸，而后進入三羧酸循環.

Cupriavidus metallidurans CH34是從污染廢水處理池的沉淀物中分離得到的一種細菌.該細菌具有較好的苯酚降解能力，還可在以甲苯酚、苯甲酸、苯胺等芳香族化合物為唯一碳源和能源的培養基中生長.高振賢等［3］和宋水山等［4］的研究表明，該菌種降解苯酚的速率常數為0.33，最適pH為7.0，最適溫度為30℃.CH34基因組的測序工作已于2002年9月完成，其染色體大小為3.9 Mb，含有3個大質粒：Megaplasmid(2.6 Mb)，pMOL 28(171 kb)和pMOL 30(234 kb).

本研究利用GenBank數據庫，通過比較基因組學分析，發現CH34基因組中存在新穎的苯酚降解基因簇結構.序列注釋分析發現，CH34同時具備鄰位與間位2種不同開環路徑的苯酚降解基因簇，其各自的苯酚羥化酶大亞基(LmPH)氨基酸序列在系統發育地位上存在較大差異，這預示著CH34可能有其獨特的苯酚降解機理和調控機制.因此，對該菌株的降酚基因簇展開深入的功能研究，不僅可以對微生物降解苯酚的分子機制起到驗證和補足的作用，同時也可以為生物處理污水中的苯酚等污染物提供優良的功能基因.本研究采用pIndigo-BAC 5載體構建了CH34的細菌人工染色體(bacterial artificial chromosome，BAC)基因組文庫.根據降酚基因簇LmPH的phlN基因設計引物，用PCR的方法從BAC文庫中篩選到了分別含有2個完整苯酚降解基因簇的單克隆，并分別檢測了這2個降酚基因簇在大腸桿菌中對苯酚的降解能力，為今后篩選高效的降酚基因簇和研制可應用于環境治理的基因工程菌奠定了理論基礎.

1 材料和方法

1.1 材料

菌株C.metallidurans CH34購于美國模式培養物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，BAC載體pIndigo-BAC 5購于EpiCentre公司，低熔點瓊脂糖膠和大腸桿菌(E.coli)感受態細胞DH10B購于Invitrogen公司，脈沖場凝膠電泳用Marker購于 NEB公司，限制性內切酶 NotⅠ，HindⅢ和 XbaⅠ購于 Fermentas公司，Taq DNA Polymerase和dNTP購于TaKaRa公司.

1.2 方法

1.2.1 BAC文庫的構建

隨著大片段DNA插入技術的發展，科學家們克服了制約BAC文庫發展的瓶頸，從而為大規模的文庫構建及大基因組文庫的構建奠定了基礎［5］.BAC文庫除了插入片段較大外，還具有遺傳穩定性好、嵌合現象低等優點［6-7］，因此，本研究試圖通過構建CH34的BAC文庫，來研究其2個苯酚降解基因簇的功能.

首先提取高分子量的CH34基因組DNA，將DNA保存于低熔點瓊脂糖制備的膠塊中，膠塊保存于0.1 mol/L EDTA中，確定最佳酶切條件后，開始正式酶切.取適量的DNA進行酶切，為得到大小更為集中的片段，一般進行兩次脈沖場電泳［8］.第一次脈沖場電泳的條件為：1%瓊脂糖凝膠，0.5×TBE，6 V/cm電壓，90 s脈沖時間，14℃電泳16 h以分離酶切的片段.第二次脈沖場電泳的條件為：1%瓊脂糖凝膠，0.5×TBE，4 V/cm電壓，5 s脈沖時間，14℃電泳5 h.以分子Marker為參照，切下片段大小在100～300 kb的DNA膠塊，裝入透析袋，電洗脫得到所需的DNA片段［9］.與DNA標準濃度梯度比較，確定得到的大片段DNA的濃度.以載體與目的片段摩爾比為5∶1的比例進行連接，連接體系總體積為50 μL，連接反應于16℃進行約10 h，得到的連接產物于65℃處理15 min，以使 T4 DNA連接酶失活［10］.對連接產物進行脫鹽和濃縮處理以提高轉化效率［11］，然后電擊轉化感受態大腸桿菌［12］.從得到的轉化子中隨機挑選96個克隆，LB液體培養后，通過堿裂解法抽取BAC質粒，酶切后進行脈沖場電泳，以確定插入片段的大小.

1.2.2 陽性克隆的篩選

根據CH34的2個苯酚降解基因簇的大亞基分別設計了2對引物，其中用于篩選長簇的引物序列為 ch1f(5'-AACGCACTCAAGGTGTTTATCCAGG-3')，ch1r(5'-GCGAAGGTCTGATGGCTGATGTG-3')，用于篩選短簇的引物序列為ch2f(5'-CCTGTCCGTGCCGAAGTCGTATTT-3')，ch2r(5'-CAGAAGTGGTAGTGCTCGCCGTTG-3').從BAC文庫中隨機挑選約3 000個克隆，通過堿裂解法抽取BAC質粒，PCR擴增后進行瓊脂糖電泳，根據是否出現單一的目的條帶來篩選陽性克隆.

1.2.3 完整插入的陽性克隆挑選

對篩選到的5個含有長簇的陽性克隆以及4個含有短簇的陽性克隆分別抽取BAC質粒，用ScaⅠ酶切后進行瓊脂糖電泳.根據切開的條帶大小，與2個降酚基因簇的酶切圖譜進行對照，各自挑選一個完整插入該簇的克隆，用于后續的功能分析.

1.2.4 陽性克隆的功能分析

把2個含有長短降酚基因簇的陽性克隆，分別接種到以苯酚為唯一碳源，且含有不同質量濃度梯度苯酚的無機鹽培養基中，其中苯酚的質量濃度分別為50，100，200，500，800 mg/L.每個克隆進行3次平行實驗，取平行實驗的平均值作為實驗數據.每隔24 h取一次樣，測菌液的OD600以確定菌體濃度.用改進的4-氨基安替比啉法測定菌液中的苯酚質量濃度［13］：取菌液離心上清液80 μL于10 mL離心管中，加蒸餾水至4 mL，混勻后先后加入80 μL 2%的4-氨基安替比林溶液和80 μL 8%的鐵氰化鉀溶液，混勻后測定其在500 nm處的吸光值.根據苯酚質量濃度標準曲線獲知樣品中剩余苯酚的量，計算菌體對苯酚的利用率.當菌體濃度開始下降，即培養基中的苯酚利用殆盡時，終止取樣.

2 結果與分析

2.1 文庫的構建與鑒定

由于菌株CH34基因組的GC含量較高，NotⅠ酶切后產生的條帶較多，不便于文庫插入片段大小的鑒定.通過對CH34基因組的分析，為了更方便準確地確定文庫插入片段的大小，選用XbaⅠ進行酶切，并對該文庫插入片段的大小進行了鑒定，結果如圖1所示，其中1～25為樣品編號，M為1 kb Marker.鑒定時，隨機挑取96個克隆.酶切結果表明，98%的克隆含有插入片段，插入大小分布在20～120 kb之間，平均大小約為30 kb，其中約有61%的克隆插入片段大于50 kb.根據平均插入片段(約30 kb)和文庫的總容量(約3萬克隆)計算，此文庫覆蓋了約9 000 Mb的基因組序列.根據CH34基因組7.25 Mb大小估算，此文庫約覆蓋了CH34基因組的1 240倍.

圖1 C.metallidurans CH34的25個BAC文庫克隆XbaⅠ酶酶切圖譜Fig.1 XbaⅠrestriction map of the 25 clones from the BAC library of C.metallidurans CH34

2.2 文庫的篩選

從文庫中隨機挑選3 000個克隆，并最終得到了5個長簇的陽性克隆(見圖2，其中1為負對照，2～6為樣品編號，7為正對照，M為100 bp Marker)和4個短簇陽性克隆(見圖3，其中1～4為樣品編號，5為正對照，6為負對照，M為100 bp Marker).對得到的9個陽性克隆攜帶的苯酚羥化酶基因進行測序分析，發現與NCBI中已收錄的C.metallidurans CH34的苯酚羥化酶基因序列完全一致，這說明本實驗構建的BAC文庫中的克隆，其插入的基因組序列不會發生突變，具有很好的穩定性.

圖2 根據長簇的LmPH基因設計引物，篩選到的5個陽性克隆的PCR擴增結果Fig.2 PCR amplification ofthe 5 positive clones according to the LmPH gene on the longer cluster

圖3 根據短簇的LmPH基因設計引物，篩選到的4個陽性克隆的PCR擴增結果Fig.3 PCR amplification of the 4 positive clones according to the LmPH gene on the shorter cluster

2.3 陽性克隆的選取

9個陽性克隆BAC質粒DNA經ScaⅠ酶切后的電泳結果如圖4所示，其中1～5為含有長簇的陽性克隆，6～9為含有短簇的陽性克隆，M為1 kb Marker.CH34長短2個苯酚降解基因簇的酶切位點圖譜如圖5所示.結果顯示，長簇的4號克隆和短簇的2號克隆為擁有完整降酚基因簇的克隆.

圖4 9個陽性克隆經ScaⅠ酶切后的電泳圖Fig.4 Electrophoresis of the 9 positive clones digested with ScaⅠ

圖5 C.metallidurans CH34長短2個苯酚降解基因簇的酶切位點圖譜Fig.5 Restriction map of the 2 phenol-degradating gene clusters from C.metallidurans CH34

2.4 陽性克隆的功能分析

表1為長簇的4號克隆和短簇的2號克隆所轉化的大腸桿菌在不同苯酚質量濃度下的生長情況，表2和表3為這2個克隆對苯酚的利用效率.可以看出，2個轉化子在苯酚質量濃度較低時生長較好，但當苯酚質量濃度達到800 mg/L時，幾乎不生長;在相同苯酚質量濃度下，含有短簇的轉化子的生長狀況以及苯酚利用情況都優于含有長簇的轉化子;2個轉化子在苯酚質量濃度較低時，對苯酚的利用率均較高.研究還發現，作為負對照的含有空載BAC質粒的大腸桿菌，在苯酚質量濃度較低時也表現出了一定的苯酚利用率，推測可能大腸桿菌本身就具有一定的苯酚耐受性.

3 結束語

本研究構建的BAC文庫覆蓋了C.metallidurans CH34基因組約1 240倍，具有很好的覆蓋率，適合用于基因簇大片段的克隆和鑒定，為深入研究多套降酚基因簇在大腸桿菌細胞內的表達(例如，存在拮抗還是促進作用)打下了堅實的基礎.

從結果上看，含有長簇和短簇的轉化子在含有較低質量濃度的苯酚培養基中，降酚能力均較好，但隨著苯酚質量濃度的升高，其生長能力及降酚效率都出現了降低，表明CH34苯酚降解基因簇在大腸桿菌中表現為低質量濃度苯酚耐受性.在相同苯酚質量濃度下，短簇轉化子的降酚能力強于長簇，可能是由于長簇上存在多個編碼反式抑制因子的基因，阻礙了苯酚降解基因的轉錄.此外，從這2個簇的序列和基因排布上看，它們存在很大的差異，且長簇的一側重復出現了部分降解基因PLMN等.因此，本研究通過構建BAC文庫，克隆到2個完整的苯酚降解基因簇，并研究其在大腸桿菌中對苯酚的利用效率，從而能夠較直觀地反映兩簇的整體降酚能力.今后的研究將深入探討2個簇之間的互作關系，通過選擇合適的載體，把2個苯酚降解基因簇連到同一載體上，比較所得轉化子與只含有一個簇的轉化子在降酚能力方面的差異，從而確定這2個簇之間是否存在促進或拮抗的相互作用.

表1 2個陽性克隆在不同苯酚質量濃度下的生長情況(OD600)Table 1 Growth of the 2 positive clones in different phenol concentrations(OD600)

表2 2個陽性克隆在不同苯酚質量濃度下對苯酚的利用情況(OD500)Table 2 Phenol utilization of the 2 positive clones in different phenol concentrations(OD500)

表3 2個陽性克隆在不同苯酚質量濃度下對苯酚的降解效率Table 3 Degradation efficiency of the 2 positive clones in different phenol concentrations %

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