牛γ-干擾素在大腸桿菌中的表達及抗原性鑒定

劉巧榮，孫 明，喬明明，楊 璐，申屠芬琴，馬永纓，曹 振，田克恭，陳西釗，

（1.北京世紀元亨動物防疫技術有限公司，北京 100085；2.中國動物疫病預防控制中心，北京 100094）

研究意義：干擾素（interferon，IFN）是一種多效性細胞因子，主要由活化的 T淋巴細胞產生，具有廣泛抗病毒、抗腫瘤及免疫調節功能。根據產生干擾素的細胞來源、理化性質及生物學活性的差異，哺乳動物的干擾素可分為 5類，即 α、β、τ、ω及γ［1］。與其它型比，IFN-γ除具有抗病毒活性和抗腫瘤活性外，還有更強的免疫調節活性，能促進MHC II類抗原表達、增強抗原提呈細胞（antigen presenting cell，APC）與 T細胞的相互作用、增強輔助性T細胞活性和細胞毒性T細胞產生的能力等，是機體發揮免疫功能，清除體內病原體不可缺少的成分，因此，IFN-γ成為現代分子生物學，免疫學和臨床醫學研究的熱點之一。

前人的研究進展：Douglas等（1986）首先對BovIFN-γ進行了原核表達，發現重組 BovIFN-γ蛋白在MDBK細胞系上的活性為 1.15×105U/m L。此后，國內外學者用大腸桿菌、畢赤酵母、皰疹病毒和桿狀病毒等表達載體對其進行了表達研究［2-6］。研究表明，BovIFN-γ在抗水泡性口炎病毒、口蹄疫病毒、牛病毒性腹瀉病毒、牛呼吸道合胞體病毒、牛白血病病毒以及副流感-3型病毒的試驗中均取得了良好效果。另外，通過檢測牛血液中的 IFN-γ用于診斷牛結核病，目前已經有BovIFN-γ檢測試劑盒出售［7］。

本研究切入點：本研究旨在應用基因工程技術實現BovIFN-γ的高效表達，鑒定其抗原活性。為制備BovIFN-γ檢測試劑盒奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 載體和菌株

pGEM-T-Easy、PET-28a載體，購自 Promega公司。

1.2 主要試劑

TaqDNA聚合酶、dNTP和膠回收試劑盒購自Promega公司，氨芐青霉素和IPTG購自于Sigma公司。BovigamTM牛結核分枝桿菌 γ-干擾素檢測試劑盒購自于北京測迪公司。BovIFN-γ酶標單克隆抗體來自BovigamTM牛結核分枝桿菌γ-干擾素檢測試劑盒。內切酶Sal I和EcoR I為Takara公司產品。

1.3 目的基因克隆

參考GeneBank上BIFN-γ基因序列設計引物。上游引物：5＇-AGCGAATTCATGCAGGGCCAATTTT TTAGA-3＇，下游引物5＇-TTTGTCGACTTACGTTGAT GCTCTCCGGCCT-3＇。由寶生物工程大連有限公司合成。以人工合成的BIFN-γ基因序列為模板，克隆目的基因。

PCR擴增程序：94℃ 4 m in，94℃ 30 s，50℃30 s，72℃ 60 s，30個循環，72℃10 m in。

擴增產物用1％ 瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收。回收產物與 pGEM-T-Easy載體連接（方法參照Promega的產品使用說明），PCR方法鑒定重組質粒，并命名為pGEM-T-BIFN-γ。將鑒定正確的陽性質粒送上海英駿生物技術有限公司測序。

1.4 重組表達質粒的構建

Sal I和 EcoR I雙酶切 pGEM-T-BIFN-γ質粒，回收目的基因，連接至經同樣雙酶切的原核表達載體PET-28a中；轉化到 BL21/DE3感受態細胞中。用PCR方法和雙酶切鑒定重組質粒，將重組質粒命名為PET-28a-BIFN-γ。

1.5 誘導表達與純化

將PCR和酶切鑒定為陽性的菌在LB/AMP中37℃培養，當菌搖至 A600=0.8～1.0時，加入 IPTG至終濃度為1 mmol/L，37℃誘導培養4 h，離心收集菌體。菌體經過超聲波破碎，收集沉淀和上清液。沉淀用0.1％Triton X-100洗滌后，再用包涵體溶解液溶解。Ni-NTA親和層析法和電洗脫方法純化表達的重組蛋白。

1.6 SDS-PAGE和WesternBlot鑒定

將誘導菌液經SDS-PAGE電泳分離后，轉印到硝酸纖維素膜（NC膜）。5％脫脂奶粉封閉過夜，PBST洗滌3次，用辣根過氧化酶標記的抗BovIFN-γ單抗37℃孵育1h，洗滌3次后用二氨基聯苯胺（3，3＇-diam inobenzidine，DAB）顯色液顯色1～5 min，觀察結果。

1.7 ELISA檢測鑒定

將純化的BovIFN-γ重組蛋白作相應倍數稀釋，作為待檢抗原和 γ-干擾素檢測試劑盒的標準品分別加入到預先包被BovIFN-γ抗體的酶標板中，溫育1 h，洗滌3次，再加入酶標抗 BovIFN-γ的單克隆抗體，溫育1 h，洗滌3次。加入底物顯色10 min，再加入終止液。450 nm波長下測定A值，根據標準品和樣品的A值，判定陰陽性。

2 結果

2.1 目的基因擴增

以合成的BovIFN-γDNA序列為模板進行PCR擴增。擴增的基因大小與預期大小一致（圖1）。測序結果顯示，克隆的基因片段大小為 429 bp，與M29867的序列完全相同。

圖1 BovIFN-γ的PCR結果1.Bov IFN-γgene；2：Negative control；M：DL 2000 markerFig.1 PCR products of BovIFN-γ

2.2 表達載體構建

BovIFN-γ與表達載體 PET-28a連接轉化到BL21/DE3感受態細胞中。菌液PCR鑒定（圖2）顯示擴增的基因大小與目的基因大小一致，重組質粒PET-28a-BIFN-γ酶切結果見圖3。片段大小與預期結果一致，表明成功構建原核表達載體。

2.3 PET-28a-BIFN-γ的誘導表達、純化及WesternBlot鑒定

圖2 PET-28a-BIFN-γ菌液PCR鑒定M：DL 2000 marker；1：PET-28a-BIFN-γbacilli； 2：Negative controlFig.2 PCR identification of PET-28a-BIFN-γ

牛干擾素在 PET-28a中的表達情況以及Western Blot鑒定結果分別見圖4和圖5。結果顯示重組質粒在 E.coli BL21/DE3中實現了高效表達，分子量約為17 kDa左右。目的蛋白以包涵體和可溶性兩種形式存在，且以可溶性表達為主。經Alpha成像儀掃描分析，表達蛋白約占菌體總蛋白的32％。菌體裂解上清經Ni-NTA親和層析和電洗脫方法純化后得到純度較高的重組蛋白，濃度分別為0.56 mg/m L和2.6 mg/m L。Western blot鑒定結果表明兩種方法純化的牛干擾素蛋白均可和酶標BovIFN-γ單克隆抗體反應（圖5），具有很好的抗原反應活性。

圖3 PET-28a-BIFN-γ酶切鑒定M：DL 2000 marker；1：Recombinantplasmids of PET-28a-BIFN-γ；Fig.3 Restriction enzyme digestion of PET-28a-BIFN-γ

圖4 PET-28a-r-BIFN表達情況M：Low molecular weight protein marker；1：Control without induction；2：Expressions of recombinant plasmid induced by IPTG；3：Products of bacterial lysate supernatant；4：Products of bacterial lysate precipitation；5：Affinity chromatography purfied protein；6：Electroelution purfied proteinFig.4 SDS-PAGE analysis of PET-28a-r-BIFN protein expressed in BL21

2.4 ELISA

用γ-干擾素檢測試劑盒分別檢測兩種純化的PET-28a-BIFN-γ重組蛋白。結果見表1，由表看出，電洗脫和親和層析純化的 BovIFN-γ濃度分別大于或等于0.13μg/m L和0.0056μg/m L時為陽性。

表1 電洗脫與親和層析純化抗原ELISA檢測A450結果Tab.1 ELISA results of purfied protein determined by electroelution and affinity chromatography

圖5 Western Blot1：Protein purified by electroelution 2：Protein purified by affinity chromatographyFig.5 Western blot results

3 討論

BovIFN-γ可用于牛的一些病毒性疾病的防治，也可用于牛結核病的診斷［7，11］。牛結核病的 IFN-γ診斷法是1990年由Wood等建立，其原理是將試驗牛的血液淋巴細胞培育，加入特異性抗原（如牛結核菌素，ESAT-6等）一起孵育16～24 h，感染牛結核的淋巴細胞釋放多量 IFN-γ，未感染牛結核的淋巴細胞不釋放或釋放少量 IFN-γ，通過檢測淋巴細胞培養上清中IFN-γ量的變化來診斷牛結核病。2000年世界牛分枝桿菌會議后，IFN-γ檢測方法在許多國家推廣使用，且己有檢測試劑盒出售。這種方法的敏感性和特異性較高，其敏感度可達93.6％，遠遠高于傳統的皮內試驗65.6％的靈敏度［12］，且能檢測出早期感染牛分枝桿菌的牛，降低了傳染的風險［13］。可見IFN-γ檢測方法具有良好的應用前景。

目前國內外用于診斷牛結核病的檢驗方法分為三類：第一類是細菌學方法，如涂片鏡檢、細菌培養等。鏡檢簡便、快速，檢測的靈敏度低；細菌培養耗費時間，檢測陽性率低。第二類是免疫學方法，包括結核菌素變態反應（TST）、ELISA和 γ干擾素檢測法等。TST是臨床上應用最廣的方法，也是國際獸醫局推薦的牛結核病診斷的唯一方法。ELISA和γ干擾素實驗法通過檢測結核菌的特異性抗體或細胞因子等，可檢出處于不同感染時期（潛伏感染期、疾病期）的牛，簡便快速、檢測陽性率較高。第三類是分子生物學方法，如PCR、核酸探針、基因芯片等，檢測的陽性率高于細菌學方法，但檢出的病牛也已處于傳染期。故應用 ELISA技術檢測BovIFN-γ以鑒定牛結核病的感染情況不失為一種快速、有效的方法。

本研究表達的重組蛋白主要以可溶性形式存在于菌體裂解上清中。試驗用親和層析和電洗脫兩種方法純化重組蛋白，純化蛋白均能與試劑盒中的BovIFN-γ單克隆抗體發生特異性反應。ELISA試驗結果顯示Ni-NTA親和層析純化的BovIFN-γ與BovIFN-γ單克隆抗體的反應活性明顯高于電洗脫方法純化的蛋白。如濃度為0.056 ug/m l親和層析法純化的BovIFN-γ仍與BovIFN-γ單克隆抗體呈強陽性反應（A450值 =1.924），而相當濃度（0.065 μg/m L）的電洗脫方法純化的蛋白與BovIFN-γ單克隆抗體呈陰性反應（A450值 =0.120）。

本研究在大腸桿菌中成功表達了BovIFN-γ，純化的蛋白能被 BovIFN-γ單克隆抗體識別，其中 Ni-NTA親和層析純化蛋白的活性明顯高于電洗脫方法純化蛋白的活性。為制備抗 BovIFN-γ的單克隆抗體以及建立BovIFN-γ檢測試劑盒奠定了基礎。

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