香煙煙霧暴露對大鼠支氣管肺泡灌洗液及外周血4-HNE和γ-GCS表達的影響

張 莉，許建英

（山西醫科大學第一醫院，太原 030001）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease COPD）是一種以氣道不完全可逆性阻塞為特征的慢性炎癥性疾病，吸煙是其發生發展的重要病因，氧化/抗氧化失衡為其主要的發病機制之一［1］。4-HNE是脂質過氧化反應醛基產物中最具代表性的物質［2］，在 COPD患者中，4-HNE水平的升高在肺部炎癥的信號轉導中發揮作用，導致炎癥介質和保護性抗氧化基因表達的失衡。γ-GCS是谷胱甘肽合成過程中的限速酶，它的數量、活性等直接影響谷胱甘肽的水平［3］，有學者發現［4］吸煙所致COPD大鼠肺組織中 γ-GCS含量較之不吸煙大鼠明顯增高，研究亦證實［5］4-HNE對大鼠肺泡上皮細胞中γ-GCS的合成有明顯的促進作用，另有部分研究表明，γ-GCS在不吸煙者肺組織中較之吸煙者有更高的水平。以往對4-HNE和γ-GCS的研究多集中在細胞水平，本實驗通過觀察不同吸煙量、吸煙持續時間對大鼠BALF及外周血4-HNE和γ-GCS表達的影響及其相關性，探討4-HNE及 γ-GCS在 COPD氧化/抗氧化失衡發病機制中的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗材料與儀器

6～8周齡雄性W istar大鼠{山西醫科大學實驗動物中心提供，合格證號 SXCK（晉）2009-0001}30只，平均體重（200±20）g。實驗用香煙為湖南中煙工業公司生產的芙蓉牌過濾嘴香煙（煙堿1.0 mg/支，焦油12 mg/支）。大鼠4-HNE和γ-GCS酶聯免疫吸附測定試劑盒均購自北京優博奧生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型建立與分組：實驗動物分為不吸煙組、吸煙6周組和吸煙12周組，每組10只。分籠飼養于山西醫科大學第一醫院呼吸科實驗室，室溫（20±2）℃，濕度40％ ～70％，普通飼料喂養，自由飲水進食。參照文獻［4］自制實驗性大鼠被動吸煙裝置制備模型（自動助燃裝置連接密閉玻璃箱）。吸煙組：每次吸煙15支，大約 2 h，每天吸煙2次（上、下午各一次），每周吸煙6 d，各吸煙6周、12周，不吸煙組大鼠正常飼養12周，與吸煙組飼養條件及環境相同。

1.2.2 標本采集：麻醉動物，開腹暴露腹主動脈，取動脈血4 m L，肝素抗凝，離心并留取上清，EP管分裝，-70℃冰箱中凍存ELISA備用；左肺用4 m L生理鹽水行支氣管肺泡灌洗，緩慢地經氣道把液體注入肺臟，再緩慢回抽液體，反復推抽4次，重復2次，最終回抽量約 5～6 m L。3 000 r/min離心 10 min后，取上清液，EP管分裝，保存于-70℃冰箱ELISA待用。

1.2.3 BALF及外周血中4-HNE含量的測定：采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附（ABC-ELISA）法檢測BALF及外周血中4-HNE的表達水平，實驗步驟按試劑盒說明書進行，試劑盒靈敏度pg/m L。

1.2.4 BALF及外周血中γ-GCS含量的測定：采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附（ABC-ELISA）法檢測BALF及外周血中 γ-GCS的表達水平，實驗步驟按試劑盒說明書進行，試劑盒靈敏度U/m L。1.3 統計學處理

2 結果

2.1 各組大鼠BALF及外周血4-HNE含量的比較

吸煙6周組和吸煙12周組大鼠BALF及外周血4-HNE含量分別較不吸煙組明顯增加，差異具有統計學意義（P均＜0.01），吸煙6周組4-HNE含量較吸煙12周組低（P＜0.01），差異有統計學意義。（表1）

2.2 各組大鼠BALF及外周血γ-GCS含量的比較

吸煙6周組大鼠BALF及外周血γ-GCS含量較之不吸煙組增高，（P＜0.05；P＜0.01），差異有統計學意義；吸煙12周組γ-GCS含量低于不吸煙組（P＜0.05；P＜0.01），差異也有統計學意義（表2）。

2.3 4-HNE含量與γ-GCS含量的相關分析

采用Pearson相關分析，對4-HNE含量及γ-GCS含量的實驗數據進行綜合分析，吸煙6周組BALF及外周血中二者表達呈正相關（r=0.764，r=0.674）；吸煙12周組BALF中二者表達呈負相關（r= -0.777），而在外周血中二者表達無顯著相關性。

3 討論

正常情況下，肺部產生一定量的氧化物，同時肺部具有抗氧化系統，使氧化物的產生和清除處于平衡狀態。吸煙是COPD的主要危險因素，大量的研究證明 ，吸煙者和COPD患者體內的氧化負擔加重。4-HNE是脂質過氧化反應醛基產物中最具代表性的物質，生成后能保留在細胞膜中，只有一部分向周圍介質中擴散并達到一定濃度，攻擊遠離原始自由基產生部位的靶目標。在COPD患者中，4-HNE水平的升高在肺部炎癥的信號轉導中發揮作用，導致炎癥介質和保護性抗氧化基因表達的失衡。γ-GCS是谷胱甘肽合成過程中的限速酶，分為重鏈（γ-GCS-HS）和輕鏈（γ-GCS-LS）兩個亞基，它的數量、活性等直接影響谷胱甘肽的水平。谷胱甘肽是肺部抗氧化的重要屏障，可以保護細胞免受4-HNE的損傷。已知氧化應激可刺激大鼠支氣管上皮細胞γ-GCS表達水平增加［3］。4-HNE通過對AP-1介導的信號傳導途徑的激活對γ-GCS的合成有明顯的促進作用。但也有研究表明，與吸煙者相比，γ-GCS在不吸煙者肺泡巨噬細胞中有更高的水平［12］。本研究發現：吸煙6周組大鼠 BALF及外周血4-HNE含量均顯著高于不吸煙組；吸煙 6周組大鼠BALF及外周血 γ-GCS含量較之不吸煙組增高，差異均有統計學意義，同時本研究分別對BALF及外周血中4-HNE含量與γ-GCS含量作相關性比較顯示吸煙6周組兩者的表達呈正相關，因此認為大鼠體液中4-HNE的增加在一定程度上促進了 γ-GCS的增加。有研究發現在小鼠吸入香煙煙霧1 h后，小鼠肺組織切片上與對照組相比可以觀察到4-HNE水平升高［6］。吸煙者與非吸煙者相比，在誘導痰中4-HNE含量明顯增高。還有學者證實，隨著吸煙時間的延長，支氣管肺組織中γ-GCS的mRNA及其蛋白表達水平逐漸增高，本實驗吸煙6周組與其結論基本相符［4］。有報道研究了23例（包括11例COPD和12例非COPD）現在和以往有相似吸煙年包數的肺切除患者后，證實4-HNE能在肺細胞水平上調γ-GCS的 mRNA［7］。還有研究觀察了在生理學相關劑量時4-HNE誘導GSH生物合成的信號傳導途徑，表明4-HNE通過JNK信號途徑誘導谷胱甘肽的生物合成，并指出了由AP-1驅動在人支氣管上皮細胞γ-GCS兩個亞基的基因表達中所起的巨大作用［8，9］。上述研究均提示了4-HNE在一定程度上可以誘導γ-GCS的產生，但本實驗中導致該結果的確切機制尚不清楚。

表1 4-HNE含量（pg/m L）表達（n=10，±s）Tab.1 The expression of 4-HNE in BALF and peripheral blood of the rats

表1 4-HNE含量（pg/m L）表達（n=10，±s）Tab.1 The expression of 4-HNE in BALF and peripheral blood of the rats

注：△與不吸煙組比較P＜0.01；▲與吸煙6周組比較，P＜0.01△Compared with the non-smoking group，P＜0.01；▲Compared with the 6-weeks smoking group，P＜0.01

組別Groups 肺泡灌洗液BALF 外周血Peripheral blood不吸煙組Non-smoking 15.917±1.584 12.305±1.822吸煙6周組6-weeks smoking 21.376±2.80△ 18.333±2.585△吸煙12周組12-weeks smoking 28.634±2.999▲ 22.754±3.882▲

表2 γ-GCS含量（U/mL）表達（n=10，±s）Tab.2 The expression ofγ-GCS in BALF and peripheral blood of the rats

表2 γ-GCS含量（U/mL）表達（n=10，±s）Tab.2 The expression ofγ-GCS in BALF and peripheral blood of the rats

注：△與不吸煙組比較，P＜0.05；▲與不吸煙組比較，P＜0.01；●與吸煙六周組比較，P＜0.01Note：△Compared with the non-smoking group，P＜0.05；▲Compared with the non-smoking group，P＜0.01；● Compared with the 6-weeks smoking group，P＜0.01

組別Groups 肺泡灌洗液BALF 外周血Peripheral blood不吸煙組Non-smoking 13.525±2.311 11.847±1.171吸煙6周組6-weeks smoking 15.802±1.647△ 16.221±1.577▲吸煙12周組12-weeks smoking 11.527±1.606△● 9.015±1.569▲●

本研究還發現：吸煙12周組大鼠BALF及外周血4-HNE含量高于吸煙6周組，而吸煙12周組γ-GCS含量低于不吸煙組，差異均有統計學意義。相關性分析顯示吸煙12周組外周血中4-HNE與 γ-GCS表達無相關性，而在 BALF中二者表達呈負相關，提示隨著4-HNE的大幅增加，γ-GCS逐漸呈下降趨勢，谷胱甘肽逐漸耗竭，長期香煙煙霧暴露引起了肺部氧化/抗氧化失衡，在最終導致COPD的發生發展過程中發揮著重要作用。有研究［8］發現：谷胱甘肽濃度在10μmol/L 4-HNE刺激后12 h達到最高水平，24 h后谷胱甘肽的水平開始降低，當細胞內谷胱甘肽被消耗時，細胞對4-HNE的毒性作用變得敏感。Harju等［10］通過免疫組織化學的方法對22位患有慢性阻塞性肺疾病（COPD）的患者，20位吸煙沒有患COPD者及13位終身未吸煙者進行研究，通過免疫電鏡方法評定，證實 γ-GCS重鏈和輕鏈兩個亞單位大部分顯著地表達在大氣道，與所有吸煙者相比不吸煙者中央支氣管上皮細胞γ-GCS-HS的表達顯示更高的趨勢，與吸煙者相比 γ-GCS-HS和γ-GCS-LS在不吸煙者肺泡巨噬細胞有更高的水平。此研究還表明γ-GCS在吸煙者肺部氣道內的免疫活性降低。另有研究也證實了該結論，該研究還發現γ-GCS在不吸煙非慢性支氣管炎者表達最強，而在吸煙者與慢性支氣管炎者的氣道內表達下調。本實驗對大鼠體液中的γ-GCS進行測定，吸煙12周組結果與在人中央支氣管上皮細胞和肺泡巨噬細胞中的變化基本一致［11］。已證實在生理條件下谷胱甘肽可以直接通過谷胱甘肽-S-轉移酶與4-HNE反應形成復合物排出細胞，在4-HNE導致谷胱甘肽逐漸消耗中發揮作用，而在具體不同的細胞系中，該代謝途徑仍報道不一［12］。至于該解毒機制是否導致了本實驗中γ-GCS的逐漸降低，尚需后續的實驗來證實。

氧化/抗氧化失衡是COPD的重要發病機制，近年來人們對4-HNE的認識已逐漸深入，長期接觸香煙煙霧會導致肺內氧化產物的大量蓄積和抗氧化劑的不斷消耗，4-HNE的不斷增加與抗氧化酶 γ-GCS的逐漸消耗可能在COPD的發生發展過程中發揮重要作用，在未來的發展中，進一步深入探索二者表達的失衡與吸煙所致COPD的關系，有助于發現新的治療方法用以預防或治療慢性阻塞性肺疾病。

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