四氯化碳、酒精與四氯化碳聯合、膽管結扎致SD大鼠肝纖維化病理學比較

孫 俠，黃小瓊，鐘海潮，饒子亮，鐘志勇，王 剛

（廣東省醫學實驗動物中心，佛山 528248）

肝纖維化（hepatic fibrosis）是指肝臟內彌漫性細胞外基質（特別是膠原）過度沉積。它不是一個獨立的疾病，而是許多慢性肝病的共同病理過程。幾乎各種慢性肝臟疾病均可引起肝纖維化，其病因大致可分為感染性（慢性乙型、丙型和丁型病毒性肝炎，血吸蟲病等），先天性代謝缺陷（肝豆狀核變性、血色病、α1-抗胰蛋白酶缺乏癥等）及化學毒物性（慢性酒精性肝病、慢性藥物性肝病）及自身免疫性肝炎、原發性膽汁性肝硬化和原發性硬化性膽管炎等。本實驗采用3種［1-3］不同方法分別建立四氯化碳、酒精與四氯化碳聯合、膽管結扎致SD大鼠肝纖維化模型，并對3種肝纖維化模型大鼠肝臟病理學改變進行比較，初步探討肝纖維化病變發生機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠，34只，雄性，4周齡，體重180～220 g，由廣東省醫學實驗動物中心提供，動物生產許可證粵監證字號：SCXK（粵）2008-0002，實驗動物合格證號：0056726。經過實驗動物倫理委員會審查通過。

1.1.2 實驗環境

SD大鼠飼養在廣東省醫學實驗動物中心 SPF級實驗動物室，動物實驗環境設施合格證號： 0028828，室內溫度20～25℃，相對濕度40～70％，換氣量10～12次/h，照明12 h明暗交替；用標準大鼠箱飼養，每箱5只，水料充足，SPF級飼料產自廣東省醫學實驗動物中心。

1.1.3 主要試劑

四氯化碳：廣州市中南化學試劑有限公司，批號：060213；橄欖油：國藥集團化學試劑有限公司，批號：F20040614；戊巴比妥鈉：北京化學試劑公司，規格：25 g，批號：061222；酒精：北京紅星股份有限公司，規格：2 L，純度：60％；吡唑：上海晶純試劑有限公司，規格：25 g，純度：98％，批號：11169；玉米油：益海嘉里食品營銷有限公司，規格：900 m L。病理檢測試劑：乙醇、二甲苯、甲醛、蘇木素、伊紅等。

1.1.4 主要儀器

YP3001N電子d平：上海精密科學儀器有限公司；PB203-N電子分析d平：梅特勒-托利多公司產品；全自動生物組織脫水機，湖北宏業醫用儀器有限公司，型號：TS-12N；輪轉切片機，德國徠卡，型號：RM2135；全自動生物組織染色機，湖北宏業醫用儀器有限公司，型號：RS-18Ⅱ；熒光病理圖像分析系統，型號：OLYMPUS BX41。

1.2 方法

1.2.1 造模［1-3］

SD大鼠隨機分為4組：正常對照組8只，四氯化碳組8只，酒精與四氯化碳聯合組9只，膽管結扎組9只。四氯化碳組以3 mg/kg的劑量（首次劑量加倍）皮下注射50％四氯化碳（四氯化碳∶橄欖油=1∶1），每周2次，連續注射6周；酒精與四氯化碳聯合組每日按照10 m L/kg劑量灌服酒精混合物（酒精∶吡唑∶玉米油=10 mL∶25 mg∶2 mL），同時每周2次按0.3 mL/kg劑量給予腹腔注射四氯化碳：橄欖油（1∶3），連續造模60 d；膽管結扎組大鼠按10 mg/kg體重腹腔注射3％戊巴比妥鈉麻醉，腹部皮膚消毒，無菌操作沿腹部正中線剪開腹腔，分離出膽管，在膽管近端和遠端2處結扎膽管，28 d后結束造模。

1.2.2 病理學檢查

實驗結束后，將大鼠用乙醚麻醉后處死，解剖觀察肝臟病變，并采取肝臟組織用10％福爾馬林固定48 h，按常規程序制作石蠟切片，切片厚度4μm， HE染色，masson三色染色顯微鏡下觀察并拍照。觀察肝組織肝小葉結構是否紊亂，小葉內肝細胞是否變性、壞死，匯管區有無纖維組織增生、小膽管增生和炎細胞浸潤等病理改變。

1.2.3 肝纖維化病變半定量、定量分析

肝纖維化分期半定量評估采用Scheuer評分系統［4-5］：0分：無纖維化；1分：匯管區擴大；2分：匯管區纖維化，少量間隔形成；3分：纖維間隔形成明顯伴小葉結構紊亂；4分：可能或肯定的肝硬化。肝纖維化病變定量分析：每份標本在低倍視野（10× 10）下依次選取左上、右上、左下、右下、中間5個視野（共1.5 mm2），采用Image-Pro Plus 6.0軟件測定視野內肝纖維化病變總面積。

1.2.4 統計學分析

實驗數據采用SPSS16.0統計軟件，組間比較采用One-Way ANOVA比較。

2 結果

2.1 各組大鼠肝臟外觀比較

正常對照組大鼠肝臟表面暗紅，邊沿銳利，質地軟；四氯化碳組大鼠肝臟呈灰黃色，飽滿粗糙，表面有大小不等的結節，質硬，韌性大；膽管結扎組大鼠肝臟腫大，呈黃綠色，質地中等硬，膽總管自結扎處以上明顯擴張；酒精與四氯化碳聯合組大鼠肝臟較正常肝臟暗淡，質地偏硬，部分表面凹凸不平。

2.2 各組大鼠肝臟組織病理學改變

正常對照組大鼠肝臟肝小葉結構清晰，小葉內肝細胞索排列較整齊，肝細胞大小均勻，無變性、壞死，匯管區未見纖維組織增生和小膽管增生。四氯化碳組大鼠肝臟肝小葉結構不清甚至被破壞，肝細胞彌漫脂肪變性，匯管區及中央靜脈周圍見少量至中量炎性細胞浸潤，纖維組織增生較明顯。酒精與四氯化碳聯合組大鼠肝臟肝小葉結構不清甚至被破壞，局灶至彌漫肝細胞水腫伴脂肪變性，匯管區及中央靜脈周圍見少量至中量炎細胞浸潤，纖維組織增生明顯。膽管結扎組大鼠肝臟肝小葉結構不清甚至被破壞，肝細胞未見變性，小葉內及匯管區見少量至中量炎細胞浸潤，小膽管伴纖維組織增生明顯。參見彩插4圖1。

2.3 各組大鼠肝纖維化病變半定量、定量比較

四氯化碳組、酒精與四氯化碳聯合組、膽管結扎組大鼠肝纖維化程度與正常對照組比較顯著增加（P＜0.01）。結果提示四氯化碳、酒精與四氯化碳聯合、膽管結扎致SD大鼠肝纖維化模型造模基本成功。膽管結扎組大鼠肝纖維化程度較四氯化碳組、酒精與四氯化碳聯合組加重。參見表1。

3 討論

本實驗分別采用多次皮下注射50％四氯化碳、膽管近端和遠端2處結扎膽管、酒精混合液灌胃結合微量四氯化碳腹腔注射復合因素等方法成功建立肝纖維化大鼠模型。實驗結果顯示，四氯化碳、酒精與四氯化碳聯合、膽管結扎均可誘發SD大鼠肝纖維化的形成，四氯化碳組大鼠可見肝細胞的彌漫性脂肪變性和炎細胞浸潤，酒精與四氯化碳聯合組大鼠可見肝細胞的酒精性水腫伴脂肪變性和炎細胞浸潤，膽管結扎組大鼠可見小膽管的明顯增生和炎細胞浸潤。其中，膽管結扎模型屬于膽汁性肝硬化，適合于模擬臨床膽汁性肝硬化（由膽管堵塞、膽道先d畸形、寄生蟲等因素引起膽汁淤積所致肝硬化），其病變以間質、膽管增生為主，早期肝細胞正常，晚期才出現肝細胞的變性、壞死。四氯化碳模型屬于化學毒物性肝硬化，適合于模擬臨床化學藥物性肝硬化（由長期、慢性化學藥物中毒引起），其病變以肝細胞變性、壞死以及肝小葉改建為假小葉為主。酒精與四氯化碳聯合模型屬于酒精性肝硬化，適合于模擬臨床酒精性肝硬化（由長期、慢性酒精中毒引起），其病變與其它化學藥物以及各種病毒性肝炎引起肝硬化的病變相類似，均以肝細胞變性、壞死以及肝小葉改建為假小葉為主。

表1 各組SD大鼠肝臟組織纖維化半定量、定量比較Tab.1 Sem i-quantitative，quantitative comparison of SD rats liver fibrosis in each group

肝纖維化的發病機制尚未完全清楚，多項研究表明，很多不同的因素（病毒性肝炎、慢性酒精中毒、營養不良、有毒物質的損傷作用等）均可引起肝細胞的損害，如長期作用，反復發作，可導致肝內廣泛的膠原纖維增生，增多的膠原纖維來源有兩種：其一為肝細胞壞死后，肝小葉內原有的網狀支架塌陷、聚積、膠原化或由肝星狀細胞轉變為肌成纖維細胞樣細胞產生膠原纖維；其二為匯管區的成纖維細胞增生并分泌產生，廣泛增生的膠原纖維向肝小葉內延伸，分割肝小葉，嚴重時肝小葉內的膠原纖維連接成纖維間隔包繞原有的或再生的肝細胞團，形成假小葉，這些病變隨著肝細胞不斷壞死與再生而反復進行，最終形成彌漫全肝的假小葉，并導致肝內血液循環改建和肝功能障礙而形成肝硬化［6］。四氯化碳、酒精、膽管結扎這三種因素可引起肝細胞變性、小膽管增生、肝炎等肝臟損傷，后經反復作用，從而進一步導致肝內廣泛的膠原纖維增生。

目前，針對肝纖維化的治療方法［7］大致分為：①去除病因治療；②抑制肝臟炎癥；③抑制肝星狀細胞（HSC）激活和增殖，促進HSC凋亡；④抑制細胞外基質（ECM）合成，促進 ECM降解；⑤基因治療。其中，去除病因治療是治療肝纖維化最直接、有效的方法。在進行病理、藥理、毒理等方面研究時可根據實際需要選擇與病因相一致的肝纖維化實驗動物模型進行研究。

［1］范明霞，周康榮，沈繼章，等.大鼠CC14誘發的肝纖維化模型Mn-DPDPMR研究［J］.臨床放射學雜志，2004，23（8）：722 -726.

［2］王兵，朱平生.茵陳四苓散防治膽管結扎大鼠肝纖維化的實驗研究［J］.河南中醫，2005，25（7）：20-22.

［3］王磊，季光，鄭培永，等.大鼠酒精性肝纖維化復合模型的建立［J］.中西醫結合學報，2006，4（3）：281-284.

［4］Scheuer PJ，Lefkowitch JH.Liver biopsy interpretation，6 th ed.London：Saunders，2000：274.

［5］Bedossa P，Paradis V.Liver extracellular matrix in health and disease［J］.JPathol，2003，200：504-515.

［6］李玉林主編.第七版病理學.人民衛生出版社.2008，181 -182.

［7］陳瀟瀟，陸倫根.肝纖維化的臨床研究進展［J］.中國肝病學，2008，13（4）：338-340.