胚胎腎分支形態發生調控因素

王偉玲，楊寶學

（北京大學基礎醫學院藥理學系，分子心血管學教育部重點實驗室，北京 100191）

腎臟發育是一個極其精細的過程，發育的不同階段形成不同的器官（如前腎，中腎，后腎），后腎的發育起始于輸尿管芽的形成，當輸尿管芽頂端侵入后腎間充質，輸尿管芽和后腎間充質相互誘導，按時空順序依次表達相應基因，釋放轉錄因子、生長因子、細胞因子、細胞外基質和黏附分子，促使后腎發育成熟。

GDNF及其受體

膠質細胞源性神經營養因子（glial cell linederived neurotrophic factor，GDNF）是轉化生長因子-β（TGF-β）超家族的一個亞家族中的一員，屬于半胱氨酸蛋白家族。GDNF亞家族受體由兩部分構成，一部分為跨膜受體 RET，另一部分共同受體GFRα1-4（GDNF fam ily receptor）可與GDNF家族成員高度親和結合。受體與配體結合后激活以下通路：Ras/ERK、三磷酸肌醇激酶（phosphoinositide 3 kinase，PI3-kinase）、磷脂酶 C （phospholipase C gamma，PLCr）［1］，對輸尿管芽生長和分支形態發生都有促進作用。

Gdnf-/-，Ret-/-，或者Gfrα1-/-的小鼠不能形成正常的輸尿管芽，腎臟發育不良，甚至不能發育［2］，證明了GDNF在誘導輸尿管芽出芽方面發揮重要作用。對Ret-/-和野生型細胞的嵌合體研究顯示野生型細胞集中在輸尿管芽頂部，而Ret-/-突變型細胞較少［3］，提示 GDNF/Ret信號還具有促 ND細胞遷移的能力。RET激活后誘導Wnt11在輸尿管芽頂端表達，而Wnt11進一步誘導間充質中GDNF的表達［4］。另一個被RET調節的基因是Sprouty1（Spry1），在輸尿管芽生長和分支形成中起到負反饋調節作用。有趣的是 Gdnf-/-，Spry1-/-或Ret-/-，Spry1-/-的小鼠腎臟發育正常，而Gdnf-/-或Spry1-/-小鼠腎臟發育顯著異常，初步的研究證明正常情況下GDNF和FGF均受Spry1抑制，但GDNF誘導輸尿管芽出芽和延伸的作用占主要地位，當 GDNF和 Spry1敲除后FGF的抑制解除，得以發揮功能，從而能夠形成正常的 腎 臟。然 而Gdnf-/-，Spry1-/- 或Ret-/-，Spry1-/-的小鼠與野生型小鼠和Spry1單敲小鼠在分支形態發生存在顯著不同，揭示了GDNF在分支形態發生過程中的特異性作用［5］。還有一種抑制GDNF信號的分子是臂板蛋白（class 3 semaphorins，Sema3），抑制GDNF的表達和RET的磷酸化，敲除了Sema3a引起腎臟體積的短暫性增大，UB分支形成增多，在組織培養條件下過表達Sema3a后則產生相反的效果［6］。

Microarray技術檢測還發現了其他 GDNF/Ret下游的蛋白，包括趨化因子受體 Cxcr4，趨化因子Crlf1，信號抑制因子 Dusp6和 Spred2，轉錄因子Myb，Etv4，Etv5［7］，這些蛋白的作用還有待于進一步研究。最近對嵌合體的研究顯示野生型細胞分布于輸尿管芽頂端，而Etv4-/-，Etv-/-的細胞分布在輸尿管芽頂端之外的部位，與Ret-/-的細胞分布范圍類似，Etv4-/-，Etv5-/-的細胞分布更加局限，提示Etv4，Etv5可能是多個通路的下游［8］。

故一旦出芽成功，GDNF經正反饋環促進新芽不斷生長分支，分支到一定程度，GDNF又可經負反饋環，減慢輸尿管芽分支，調節輸尿管芽數量和大小。

FGF及其受體

成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factors，FGF）是由 150～200個氨基酸組成的細胞間的信號分子，在各種器官胚胎的形態發生和細胞分化過程中起著重要的作用。FGF與其膜受體FGFR結合后，FGFR發生二聚體化，激活其下游的信號通路： PLCγ途徑；Ras/Raf/MEK/ERK途徑；JAK/STAT途徑；PI3-kinase，以上 4條路徑相互作用形成復雜的網絡調節機制。

FGF7和 FGF10表達于間充質細胞，以高親和力與FGFR2b結合，激活下游信號通路，調節輸尿管芽生長和腎單位形成的數量。FGFR2等位基因在輸尿管芽特異性敲除，腎臟體積顯著性減小，輸尿管芽分支少、腎單位少、輸尿管芽莖柄稀而細。缺乏 FGF7或 FGF10小鼠的腎臟明顯小于正常小鼠，離體的輸尿管芽培養系統顯示 FGF7引起的輸尿管芽以緊湊的方式分支，無明顯的莖柄和壺腹，FGF10則刺激形成長莖柄和明顯的壺腹。FGF8 mRNA在胚胎12 d的腎臟開始表達，條件敲除掉間充質FGF8導致嚴重的腎發育不全［9］。這些結果表明FGF系列生長因子對于輸尿管芽分支形成是重要的。

最近的研究顯示FGFR1能夠與Spred1的SPR結構域和Sprouty/Spred家族中成員相連，起到抑制Ras/Raf/ERK的作用，同時 Spred能夠延長 FGFR1在細胞膜上的保留時間，使其與配體充分作用［10］，提示FGF信號與GDNF存在重疊與相互作用。而Gdnf或 Ret單敲小鼠腎臟發育顯著異常，在Gdnf或Ret單敲的基礎上去除Spry后，腎臟能夠正常發育，但是這種逆轉作用在敲除Fgf10后消失了，也就是說Gdnf-/-，Spry1-/-，Fgf10-/-小鼠腎臟發育不全，FGF10發揮作用并不依賴GDNF，提示還存在其他信號通路調控［5］。

HGF及其受體

肝細胞生長因子 （hepatocyte growth factor，HGF）屬于酪氨酸激酶受體超家族的一員，1991年，Bottaro［11］通過251I標記的 HGF與細胞蛋白的共價交聯直接證明C-MET為HGF的受體。胚胎11 d腎間充質細胞即有HGF和C-MET的表達，HGF與受體 Met特異結合后，可誘導Met上的酪氨酸磷酸化，激活細胞內多個信號通路，包括 PLC、Ras、ERK1/2和 PI3-kinase等途徑，從而調節細胞的增殖、分化、形態發生和遷移。

Vargas［12］發現 HGF能夠刺激后腎間葉細胞向上皮分化，同時在輸尿管芽的管狀形態發生中起重要作用。Montesano等［13］證實 HGF可誘導膠原凝膠培養系統中的犬腎細胞（madine darby canine kidney，MDCK）形成管狀結構。研究表明，HGF經MET介導的 PI3-kinase激活可誘導內髓集合管上皮細胞（m IMCD-3）增殖、遷移和分支，對于趨化現象和集合管形成起重要作用。Akashi Togawa［14］的研究顯示HGF能夠上調Cdc42的表達量使細胞間緊密連接蛋白降解，促進MDCK細胞遷移，進一步的實驗證明HGF的這種作用是依賴Erk通路的。

BM P及其受體

骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）為轉化生長因子-β（TGF-β）家族中的一大亞類，自從上世紀90年代最早報道了Bmp7基因缺失的小鼠腎發育不全［15］，關于 BMP在腎發育過程中作用成為研究熱點，揭示了BMP在中腎管的形成、輸尿管芽的形成、分支形態發生、腎單位祖細胞的存活和增殖等過程發揮重要作用。

BMP2在輸尿管芽周的間充質組織中表達，腎組織培養和輸尿管芽離體培養實驗顯示 BMP2可抑制輸尿管芽生長分支。BMP4和BMP5參與集合管后階段腎盂和輸尿管的發育調控，BMP4主要在中腎和輸尿管周圍間充質組織中表達，對抗后腎間充質釋放的誘導信號GDNF，抑制Wnt11表達，從而抑制中腎管不適宜位點萌芽，減少中腎異位輸尿管分支的數目以及增加輸尿管形態的延長，體外實驗表明，外源BMP4同樣抑制輸尿管芽的形成，證實這一因子有能力直接影響輸尿管芽分支形態形成［16，17］。BMP7是胚胎腎發育的重要的誘導因子，表達于后腎間充質及輸尿管芽及其衍生物 ，低濃度BMP7通過p38絲裂原活化蛋白激酶促進輸尿管芽分支形成，高濃度則抑制分支形成［18］。在體內，BMP7主要起到抑制間充質細胞的過度增生的作用，從而協調輸尿管芽分支和小管上皮的形成［19］。GREMLIN1（GREM1）是內源的 BMP4拮抗劑，Alexandre Goncalves的研究顯示 GREM1還能拮抗BMP7，Grem1敲除小鼠腎發育不全，但給予外源BMP4或BMP7抑制劑后則能形成正常的腎臟［20］。

細胞外基質

細胞外基質（extracellular matrix）是胚胎發育過程中主要有間充質細胞合成并分泌的大分子物質，包括纖維性成分 （膠原蛋白、彈性蛋白和網織蛋白）、連接蛋白（纖維粘連蛋白、層粘連蛋白）和空間充填分子 （主要為糖胺聚糖），對細胞增殖和分化發揮重要調控作用。

體外實驗顯示，在純基質膠中培養，IMCD細胞可形成多細胞包囊，在Ⅰ型膠原中培養，IMCD細胞則形成實心分支索，在膠原和基質膠混合凝膠中培養，IMCD細胞形成中空分支管狀結構，由此可見，細胞與基質相互作用在上皮組織結構形成過程中起重要作用［21］。研究這些基質成份發現，Ⅰ型膠原、層粘連蛋白和纖維連接蛋白能促進成年小鼠的 IMCD形成分支管狀結構，Ⅳ型膠原和玻連蛋白則起到抑制作用［9］。最近的研究顯示纖連蛋白能夠誘導上皮細胞產生Btbd7蛋白，Btbd7蛋白進而上調Snail2，抑制E-鈣黏蛋白表達，促進芽體裂隙的形成，體外實驗證明Btbd7具有促進MDCK細胞遷移的功能［22］。

由于輸尿管芽形成過程涉及細胞增殖、遷移、擴展，當細胞絲狀偽足向外延伸時，需要降解周圍的基質，作為降解細胞外基質的主要降解酶—基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）在分支形態發生過程同樣發揮重要作用。Catherine Arnould［23］的研究顯示 Mmp9-/-小鼠腎臟發育延遲，體內體外實驗顯示MMP9缺失后Caspase3表達上調，細胞凋亡增加，表明在腎臟發育階段 MMP9抑制間充質細胞凋亡。Mmp14-/-的小鼠腎臟發育過程中不能進行正常的分支形態發生。此外，MMP14能夠使ECM重構從而誘導分支形態發生，促進BMP的表達或自分泌形式促進細胞遷移［24］。

整合素

作為許多 ECM的受體，整合素（integrin）在胚腎發育過程中的作用不可忽視。整合素屬于細胞表面受體，α，β亞基以非共價鍵結合，介導細胞與細胞外基質相互作用，其細胞外區與特異的細胞外基質成份（如：Ⅳ型膠原、層粘連蛋白、纖維連接蛋白）結合，促進細胞粘附，其胞內區可將生物信號傳導至細胞內參與細胞的分裂、增殖。

整合素能夠誘導MDCK細胞和腎形成分支［25］。用抗體阻斷整合素的功能后，髓質集合管的形成受阻，證實整合素在髓質集合管形成過程中是不可缺的重要中介物［21］。

當在輸尿管芽特異性敲除整合素 α3亞基，腎乳頭不能形成或形成異常［26］。整合素α8在間充質細胞呈極性分布，α8缺失小鼠的輸尿管芽不能形成分支，同時間充質細胞也不能轉化為上皮細胞。β1在胚胎10.5 dUB頂端表達，Hox b7/Cre小鼠特異性敲除整合素 β1后腎臟分支形成異常，在出生后發生進行性腎損傷，并出現水通道蛋白AQP2表達的減少［25］。研究發現，由 FGF介導的經典的信號途徑也需要整合素 β1的參與。在 β1整合素敲除而FGFR維持正常活性的情況下，FGF信號依舊有所減弱［25］，因此，整合素β1除了在粘附和細胞遷移方面發揮其經典作用之外，在輸尿管芽分支形態發生中也起到介導某些生長因子信號傳導的作用。

粘附相關蛋白

介導細胞間粘附的分子，鈣黏蛋白和整合素發揮著主要作用，與細胞分裂、遷移、分化和凋亡緊密相關，在維持實體組織形成以及在生長發育過程中細胞選擇性相互聚集、重排有重要作用［27］。

鈣黏蛋白是一類鈣離子依賴的粘附分子家族，在腎臟發揮過程中有許多鈣黏蛋白的表達，輸尿管芽上主要表達E-鈣黏蛋白，而在間充質鈣黏蛋白種類存在一定的轉換［28］，鈣黏蛋白的胞漿部分與catenin相互作用，主要調節細胞骨架和信號通路轉導，敲除E-鈣黏蛋白的MDCK細胞3D培養條件下形成大量囊泡而非小管樣結構［28］。Clara Martinea-Rico等［29］將磁珠用纖連蛋白和多聚賴氨酸分別包備，與 S180細胞或過表達 E-鈣黏蛋白的細胞共孵育，而后使用雙針檢測技術（dual pipette assay）檢測將磁珠和細胞分離開的作用力，結果發現過表達E-鈣黏蛋白的細胞與纖連蛋白包備的磁珠作用力最大，也就是說E-鈣黏蛋白與纖連蛋白產生的粘附作用最強，提示鈣黏蛋白在介導細胞—基質間相互作用發揮一定作用。

還有一些蛋白雖然不屬于粘附因子，但起到細胞黏附的作用，比如 Kif26b，屬于驅動蛋白家族，作為Sall1的下游調節間充質細胞間的粘附，在胚胎10.5 d于后腎間充質表達。Kif26b-/-的間充質細胞與輸尿管芽細胞間的緊密連接減弱，整合素α8分布的極性也減弱，導致間充質的GDNF減少，過表達Kif26b使細胞間粘附增強［30］。

結語

胚胎腎的發育受多種因素的制約和調節（圖1），盡管已經知道上述因素能影響胚胎腎的發育，但還有很多機制尚不清楚。大量研究顯示成熟腎臟在病理狀態下高表達的分子，在腎臟發育過程中也高表達，而且細胞表型的改變類似于胚胎腎發育過程中后腎間充質細胞向上皮細胞轉分化的逆過程，提示腎臟損傷后細胞的再生過程和腎臟胚胎發育過程有著極其密切的關系，對腎發育的研究也有助于理解后天性腎臟疾病發生的病理生理機制。

圖1 胚胎腎分支形態發生調控因素Fig.1 Regulation of branchingmorphogenesis in kidney development

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