絲膠對2型糖尿病大鼠胰島細胞凋亡的保護作用

劉曉燕 付秀美 高 宇 陳志宏 (承德醫學院附屬醫院內分泌科，河北 承德 067000)

絲膠對2型糖尿病大鼠胰島細胞凋亡的保護作用

劉曉燕 付秀美1高 宇 陳志宏1(承德醫學院附屬醫院內分泌科，河北 承德 067000)

目的觀察絲膠對2型糖尿病大鼠胰島細胞凋亡的保護作用。方法雄性SD大鼠36隨機分為3組:正常對照組、糖尿病模型組和絲膠治療組。鏈脲佐菌素(STZ，25 mg/kg，連續3 d)腹腔注射建立2型糖尿病大鼠模型;待模型成功建立后，絲膠治療組大鼠給予絲膠灌胃(2.4 g·kg－1·d－1)35 d。免疫組織化學染色觀察胰島β細胞Bcl-2和Bax蛋白的表達。結果與正常對照組大鼠相比，模型組大鼠胰島β細胞Bax蛋白的表達明顯升高(P＜0.01)，Bcl-2蛋白的表達明顯降低(P＜0.01);與模型大鼠相比，絲膠治療組大鼠胰島β細胞Bax蛋白的表達明顯降低(P＜0.01)，Bcl-2蛋白的表達明顯升高(P＜0.01)。結論絲膠可通過上調胰島β細胞Bcl-2蛋白的表達、下調胰島β細胞Bax蛋白的表達，抑制2型糖尿病大鼠胰島細胞凋亡，對糖尿病時胰島細胞損傷具有一定的保護作用。

絲膠;2型糖尿病;胰島β細胞;Bcl-2;Bax

針對糖尿病復雜的發病機制，有學者提出胰島β細胞增殖、凋亡失衡在糖尿病發生發展的過程中具有重要作用〔1，2〕。有研究發現〔3，4〕，體內某些抗凋亡基因表達增強，可促進胰島β細胞增殖、抑制其凋亡，進而對抗血糖的升高。本研究以鏈脲佐菌素(STZ)致2型糖尿病大鼠模型為研究對象，探討了蠶繭提取物——絲膠對胰島β細胞Bcl-2和Bax蛋白表達的變化，以期為臨床治療糖尿病及其并發癥提供新思路。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 STZ購于美國Sigma公司，臨用時用pH4.4的枸櫞酸鈉-枸櫞酸緩沖液配成2%溶液。絲膠為彩色蠶繭經浸泡、水煎、過濾、濃縮而成。血糖檢測試劑盒，保定長城臨床試劑有限公司，批號:20071030。兔抗Bax及Bcl-2多克隆抗體，美國Santa Cruz公司，購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 實驗動物的選擇及分組 清潔級雄性SD大鼠36只，分為正常對照組、糖尿病模型組和絲膠治療組(n=12)。隨機選取其中的12只作為正常對照組，不做任何處理。其余24只大鼠采用小劑量STZ連續(25 mg/kg，3 d)腹腔注射的方法建立2型糖尿病模型，以血糖≥16.7 mmol/L作為成模標準;待模型成功建立后，隨機分為模型組和絲膠治療組(n=12)，模型組大鼠不再做任何處理，絲膠治療組大鼠給予絲膠(2.4 g·kg－1·d－1)灌胃 35 d。

1.3 檢測血糖 各組大鼠用藥結束后禁食12 h以上，4%水合氯醛腹腔注射麻醉，經內眥于眶后靜脈叢采血，離心后收集血清，采用葡萄糖氧化酶法檢測血糖。

1.4 胰島β細胞Bcl-2和Bax蛋白表達的檢測 大鼠取血后斷頭處死，取胰腺入Bouins液固定，常規石蠟包埋，連續切片，片厚5μm。采用SP免疫組織化學染色觀察胰島β細胞Bcl-2和Bax蛋白的表達。一抗均為兔抗，稀釋濃度Bcl-2為1∶50、Bax為1∶100，DAB顯色，蘇木素復染。以PBS代替一抗作為陰性對照，以胞漿中出現棕黃色顆粒為陽性反應。定量分析:采用MiVnt圖像分析系統在10×40倍顯微鏡下對免疫組化陽性結果進行定量分析，每張切片隨機選取胰島作為觀察視野，計算陽性產物面積占胰島面積的比值。每組隨機選取5只大鼠，每只大鼠任選5張切片，每張切片選取3個胰島，取平均值。

2 結果

2.1 各組大鼠的血糖 糖尿病模型大鼠的血糖明顯高于正常大鼠(P＜0.01)，絲膠治療組大鼠的血糖明顯低于模型大鼠(P＜0.01)。見表1。

表1 各組大鼠血糖及胰島β細胞Bcl-2 Bax蛋白表達的比較(±s，n=12)

表1 各組大鼠血糖及胰島β細胞Bcl-2 Bax蛋白表達的比較(±s，n=12)

與模型組比較:1)P＜0.01

組別 血糖(mmol/L)Bcl-2 Bax正常對照組 10.83±2.031) 0.017 4±0.000 81)0.301 5±0.017 41)模型組 29.45±4.82 0.007 6±0.000 6 0.539 8±0.041 1絲膠治療組 13.20±4.091) 0.017 1±0.000 21)0.308 0±0.013 41)

2.2 各組大鼠胰島β細胞Bcl-2蛋白的表達 Bcl-2蛋白免疫陽性產物為棕黃色顆粒狀，位于細胞質，免疫陽性細胞主要為胰島β細胞(圖1)。Bcl-2蛋白定量分析結果見表1，糖尿病模型大鼠胰島β細胞Bcl-2蛋白的表達明顯低于正常大鼠(P＜0.01);絲膠可明顯提高糖尿病模型大鼠胰島β細胞Bcl-2蛋白的表達，絲膠治療組大鼠胰島β細胞Bcl-2蛋白的表達明顯高于糖尿病模型大鼠(P＜0.01)。

2.3 各組大鼠胰島β細胞Bax蛋白的表達 Bax蛋白免疫陽性產物為棕黃色顆粒狀，位于細胞質，免疫陽性細胞主要為胰島β細胞(圖2)。Bax蛋白定量分析結果見表1，糖尿病模型大鼠胰島β細胞Bax蛋白的表達明顯高于正常大鼠(P＜0.01);絲膠可明顯降低糖尿病模型大鼠胰島β細胞Bax蛋白的表達，絲膠治療組大鼠胰島β細胞Bax蛋白的表達明顯低于糖尿病模型大鼠(P＜0.01)。

圖1 各組大鼠胰島β細胞Bcl-2蛋白的表達(×400)

圖2 各組大鼠胰島β細胞Bax蛋白的表達(×400)

3 討論

Bcl-2是目前公認的抗凋亡基因，可通過多種途徑抑制細胞凋亡〔5，6〕;Bax是Bcl-2家族成員之一，可互相結合形成同源二聚體，誘導和促進細胞凋亡〔7，8〕。Bcl-2蛋白可以與Bax蛋白競爭結合，形成比Bax-Bax同源二聚體更穩定的Bcl-2-Bax異源二聚體，從而使Bax-Bax同源二聚體分開，減弱Bax蛋白的誘導凋亡作用。因此，細胞凋亡抑制因子Bcl-2和細胞凋亡促進因子Bax比率不同將決定細胞受到凋亡刺激信號后是生存還是凋亡，Bcl-2占優勢則細胞存活，Bax占優勢則細胞凋亡〔9〕。目前認為，在糖尿病的發生發展過程中，Bcl-2表達降低和(或)Bax表達升高是促使胰島β細胞凋亡的重要原因之一。Federici等〔10〕的研究表明，高糖可導致Bax過度表達，使胰島β細胞凋亡增加，提示高糖可通過改變Bcl-2家族之間的平衡影響β細胞的凋亡。

糖尿病屬中國傳統醫學“消渴癥”范疇，治療原則為生精清熱、潤燥養陰等。蠶繭，蠶蛾科昆蟲家蠶蛾的繭殼，性甘、溫，無毒，具有滋陰潤燥、生精止渴作用，主治多飲、不生肌肉、腎消白濁和上中二消〔11，12〕。絲膠為天然高分子水溶性蛋白，約占繭絲的30%，在繅絲和精練時極大部分作為廢料遭到遺棄，學者們一直在探討對絲膠的有效利用。本研究發現，絲膠可明顯上調糖尿病模型大鼠胰島β細胞Bcl-2蛋白的表達、下調胰島β細胞Bax蛋白的表達。一方面，增多的Bcl-2蛋白可通過阻斷凋亡信號傳遞和凋亡基因產物的表達、提高抗氧化能力抑制胰島β細胞的凋亡;另一方面，增多的Bcl-2蛋白可與Bax蛋白競爭結合形成Bcl-2-Bax異源二聚體，減弱Bax蛋白誘導β細胞凋亡的作用。因此，本研究表明絲膠可明顯抑制糖尿病時胰島β細胞的凋亡，可保護糖尿病時胰島β細胞損傷，對糖尿病及其并發癥具有一定的治療作用。

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9 Del Principe MI，Del Poeta G，Venditti A，et al.Apoptosis and immaturity in acutemyeloid leukemia〔J〕.Hematology，2005;10(1):25-34.

10 FedericiM，Hribal M，Perego L，et al.High glucose causes apoptosis in cultured human pancreatic islets of Langerhans:a potential role for regulation of specific Bcl family genes toward an apoptotic cell death program〔J〕.Diabetes，2001;50(6):1290-301.

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12 鮑相敖.驗方新編〔M〕.天津:天津科技出版社，1993:736-40.

Protective effects of sericin on islet cells apoptosis of type 2 diabetes rats

LIU Xiao-Yan，FU Xiu-M ei，GAO Yu，et al.
Department of Endocrinology，the A ffiliated Hospital of Chengde M edical College，Chengde 067000，Hebei，China

ObjectiveTo observe the protective effects of sericin on islet cells apoptosis of type2 diabetes rats.Methods36male SD rats were random ly divided into 3 groups and each group had 12 rats:normal control，diabetesmodel and sericin treatment groups.Diabetesmodel weremade by injecting 2%STZ(25mg/kg，3 d)into the abdominal cavity continuously.After the diabetesmodelwas successfully established，the rats in model group had no more treatment;the rats in sericin treatment group were lavaged with sericin(2.4 g·kg－1·d－1)for 35 days.SP immunohistochemical staining was used to observe the expression of Bcl-2 and Bax protein in β cells of islet.ResultsCompared with normal control rats，the Bcl-2 expression inβ cells of islet of rats inmodel group was decreased obviously，Bax expression increased obviously(P＜0.01).Compared with model rats，the Bcl-2 expression inβcells of islet of rats in sericin treatmentwas increased obviously，Bax expression decreased obviously(P＜0.01).ConclusionsSericin can inhibitβ cell apoptosis by up-regulating Bcl-2 expression and downregulating Bax expression and have protective effects onβcells injury during diabetes.

Sericin;Type 2 diabetes;βcell of islet;Bcl-2;Bax

R587

A

1005-9202(2012)12-2525-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.12.039

河北省科技廳項目(No.08276101D-19);河北省教育廳項目(No.2006301)

1 承德醫學院人體解剖學教研室

陳志宏(1971-)，女，博士，教授，碩士生導師，主要從事神經解剖學研究。

劉曉燕(1965-)，女，碩士，副主任醫師，副教授，主要從事糖尿病神經病變臨床研究。

〔2011-09-16收稿 2011-12-20修回〕

(編輯 曹夢園)