氟化鈉對小鼠睪丸組織的損傷及細胞凋亡的影響

趙燕凌，張 斌，宋國華，劉茂林，高繼平

（1.山西醫科大學醫學影像系，太原 030001；2.山西醫科大學實驗動物中心，太原 030001）

氟作為機體生命活動所必需的微量元素之一，它廣泛存在于飲水、土壤、大氣和動植物體內，但機體長期過量攝入可導致慢性氟中毒。氟對雄性生殖系統有毒性作用，可直接作用于睪丸、附睪、前列腺等，破壞其結構，導致生育能力的下降［1］。研究表明間質細胞受損，線粒體和滑面內質網的變化顯著，可能通過增強脂質過氧化作用，抑制物質和能量代謝過程，損傷DNA等途徑對雄性生殖系統結構和功能造成直接損害［2］。氟對雄性生殖系統的損害是多途徑、十分復雜的過程，關于氟致睪丸間質細胞凋亡作用和機制仍不十分清楚［3］。因此，氟對雄性生殖系統的影響日益受到重視。

本研究選用小鼠建立氟染毒模型，對氟染毒小鼠睪丸組織的結構和組織凋亡進行分析，觀察氟對小鼠睪丸組織病理學變化，用TUNEL技術檢測睪丸組織細胞凋亡，探討氟引起睪丸組織損傷和凋亡的機制。

1 材料和方法

1.1 材料

動物：健康雄性昆明小鼠40只，由山西醫科大學實驗動物中心提供（SCXK［晉］2009-001）。

試劑：氟化鈉（NaF，分析純，購自天津化學試劑廠）；TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒（北京中昊生物公司）；4％多聚甲醛。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立

雄性昆明小鼠40只常規飼養1周后，隨機分為四組：對照組、低氟組、中氟組和高氟組，每組10只。根據已發表文獻［4，5］對實驗組給藥劑量和用藥時間稍作修改，對照組飼喂普通飼料，飲去離子水；低氟組、中氟組和高氟組飼喂普通飼料，分別飲用含10，25，50 mg/L氟化鈉去離子水。定時飼喂飼料，自由采食、飲水。環境溫度20～25℃。實驗期間每天觀察動物活動、飲食、排泄、反應及氟斑牙情況，同時每周稱重1次，觀察體重變化。

1.2.2 標本采集

飼喂120 d后，麻醉后解剖，迅速取其睪丸組織，生理鹽水沖洗，置于4％多聚甲醛固定液中固定24 h。

1.2.3 切片制作

睪丸組織在4％多聚甲醛中固定24 h后，自來水沖洗，去離子水沖洗，將睪丸組織用鋒利刀片沿縱向對半切割成兩塊，梯度酒精脫水，置二甲苯透明，較低溫度（低于60℃）下浸蠟，包埋。將包埋好的蠟塊置于石蠟切片機上切片，厚度為5μm。將切片漂浮于45℃溫水中，然后用0.01％多聚賴氨酸處理過的載玻片撈起，并放在烘片機上烤干。

1.2.4 HE染色

按常規方法對組織切片作HE染色，光學顯微鏡觀察組織病理學變化。

二甲苯、酒精脫蠟至水→蘇木精染色10 min，鏡下控制鹽酸酒精分化，水洗返藍→脫水到90％酒精→伊紅5 min→梯度乙醇脫水（濃度：75％-80％-90％-100％）→二甲苯透明→中性樹膠封片→光鏡下觀察睪丸組織形態。

1.2.5 原位細胞凋亡檢測

采用 TdT介導的末端標記法（TdT-mediated dUTP nick end labelin，TUNEL法）進行細胞凋亡的原位檢測，按照試劑盒說明書進行。TUNEL結果計算：400倍高倍鏡下觀察，陽性細胞的細胞核呈棕黃色，細胞核出現黃至棕褐色顆粒均為陽性細胞，凋亡細胞的形態學特征為染色質濃集、核裂解以及核周新月體樣濃集染色質，細胞內可見深色凋亡小體者為凋亡細胞。隨機選擇5個高倍視野（400倍）并計數500個細胞，記錄凋亡細胞數，計算凋亡指數（AI）：AI=凋亡細胞數/500×100％。

1.2.6 統計分析

用SPSS11.5軟件進行統計分析，各組數據以均數±標準差（±S）表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床檢查

染毒期間，對照組小鼠營養活動狀況良好，皮膚有彈性，被毛濃密有光澤，反應活躍機敏，活動敏捷，對照組小鼠的體重隨染毒時間延長呈正增長。牙齒完整有光澤，釉質棕黃色半透明。氟中毒組小鼠營養狀況較差，身體瘦弱，被毛蓬亂無光澤，反應遲鈍。下切齒失去光澤，牙釉質出現白堊樣不透明性改變，表面粗糙，變脆易磨損，長度為正常時的1/ 2，有的僅剩殘根。

2.2 病理剖檢

正常飼料對照組小鼠剖開腹腔后，可見皮下脂肪充盈，肌肉豐滿，內臟器官檢查未見異常。

染氟組小鼠剖開腹腔后，可見皮下脂肪貧瘠，肌肉緊緊附著于骨，不易剝離，內臟器官檢查見異常。

2.3 睪丸組織形態學的變化

實驗觀察到正常組睪丸間質細胞，周圍有明顯較長突起，胞體扁橢圓形，細胞核正常，核染色質分布均勻，胞質中細胞器分布正常。用光鏡觀察染氟組睪丸細胞，小鼠曲精小管退化壞死，可見細胞排列紊亂，細胞皺縮、體積縮小；胞漿結構疏松內有水腫空泡，細胞內器稀少，胞體核固縮，核染色質凝集呈塊狀分布，染色質邊集，核周出現空泡樣變化；內質網腫脹模糊不清（彩插3見圖1）。

2.4 睪丸組織凋亡檢測

顯微鏡鏡下觀察，凋亡細胞核特異性染色呈棕色，胞漿為淺棕色，非凋亡細胞為淺紫色（彩插3見圖2）。鏡下表現為細胞收縮變圓失去微絨毛，與鄰近細胞連接消失，核內染色質濃縮邊集，出現細胞膜內陷分割，并有膜包裹的凋亡小體形，TUNEL陽性細胞有的胞核略小，有的胞核呈碎片狀。氟中毒組引起大量TUNEL陽性細胞（彩插3見圖2）。與對照組比較，染氟組睪丸細胞凋亡率顯著增加，差異有統計學意義（P＜0.01），見表1。

表1 小鼠睪丸細胞凋亡率的比較Tab.1 Comparison of testis apoptosis in mouse

3 討論

3.1 高氟對動物組織的損傷

近年來氟化物對內分泌系統、神經系統、生殖系統功能的影響引起廣泛的重視，研究表明氟化物可引起小鼠和大鼠睪丸、腎近曲小管、肝臟、大腦皮質細胞的組織學改變以及激素水平的變化。有報道氟中毒對大鼠腎近曲小管上皮細胞有明顯的渾濁腫脹和空泡變性，并伴有少量炎細胞浸潤，多數腎近曲小管管腔狹窄變形，局部出現壞死崩解。發現氟中毒能明顯誘導大鼠腎臟細胞凋亡，并存在壞死［6］。崔留欣等［7］關于氟致雄性大鼠生殖功能損害的實驗研究表明，染氟組的各級生精細胞數量減少，結構疏松，成熟精子的數量下降。郭曉英［8］關于氟對大鼠肝臟功能和形態的影響及與氧化應激關系的實驗研究表明，染氟組大鼠肝細胞細胞界限不清，細胞內染色質濃縮、邊集，呈半月形聚集于核膜下；線粒體可見明顯腫脹，蠟斷裂或消失；內質網擴張；可見較多的白色脂滴；毛細膽管擴張，腔面微絨毛減少。不同日齡氟中毒三代大鼠大腦皮質細胞凋亡程度增高，氟中毒可以引起世代蓄積，接觸氟環境時間越長，其動物子代大腦損傷越嚴重［9］。Schalz等［10］研究結果認為氟可抑制小鼠血清睪酮水平，使其比對照組下降40％，氟化物毒性與動物生殖力下降呈正相關。染毒組精子計數、活動率下降，畸形率升高，血清睪酮、促黃體生成激素下降。

本研究結果及以往報道都表明，高氟會導致小鼠曲精小管退化壞死，細胞排列紊亂，細胞皺縮、體積縮小；胞漿結構疏松內有水腫空泡，細胞內器稀少，胞體核固縮，核染色質凝集呈塊狀分布，染色質邊集，核周出現空泡樣變化；內質網腫脹模糊不清。關于高氟對生殖系統毒作用機制的分子和基因水平的研究還有待于進一步探討。

3.2 染氟小鼠睪丸間質細胞凋亡

氟是一種原生質毒物，可以誘導機體不同組織發生細胞凋亡。當前，細胞凋亡已成為分子生物學、胚胎學、放射生物學、腫瘤學、免疫學和血液學的研究熱點。許多外界不良因素可以誘導機體組織的細胞凋亡。細胞凋亡是指在基因調控下的細胞自主死亡，細胞以這種主動死亡來維持組織的自身穩定。它在生物體的生長發育、衰老、組織損傷與修復以及病毒感染中都發揮重要的作用。

氟為細胞毒性物質，近年來細胞凋亡在氟中毒發病機制中的作用引起了人們的廣泛關注，人們已從多方面探討了氟化物誘導細胞凋亡的作用機制。已有研究表明，高氟對多種組織細胞的損傷不伴有炎癥反應，而以核內染色質邊集、細胞萎縮的改變為特征，此與眾多學者對細胞凋亡的描述相吻合［11］，提示細胞凋亡可能是氟致機體組織細胞損傷的重要參與因素。結構改變是不可逆的，其損害的程度與體內氟負荷密切相關。但氟究竟是如何引起睪丸病理改變、導致生殖功能損害目前不清楚。

TUNEL實際上是分子生物學與形態學相結合的研究方法，對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色，能準確地反應細胞凋亡典型的生物化學和形態特征。細胞凋亡的生化特征之一，是Ca2+、Mg2+離子依賴的內源性核酸酶的激活將核染色體從核小體間斷裂，形成由大約為180～200 bp或其多聚體組成的寡核苷酸片段，從而產生有游離粘性3＇-OH的DNA斷鏈，因此可進行凋亡細胞的檢測，即脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（term inal-deoxynucleotidyl transferasemediated nick end labeling，TUNEL）。TUNEL法是目前唯一具有普遍意義且已發展成熟的檢測方法，可實現末端定量，并可在形態學改變之前檢測到凋亡，且敏感、標記強度大［12］。根據實驗原理，TUNEL法較免疫組化法更加精確、敏感，在時序性上早于免疫組化法表達出細胞凋亡的特性，故本實驗考慮以TUNEL法的結果為準，推測氟中毒后對睪丸組織功能有明顯影響。

在氟中毒與細胞凋亡關系的研究中，國外學者主要采用體外細胞培養的方法進行實驗，觀察到培養肺細胞經氟化物處理后 DNA的損害和凋亡改變［13］。Lowth［14］給體外培養的胰島 β細胞染氟以后，電鏡下觀察到染色質邊集及DNA降解成寡聚核甘酸，呈現出凋亡特征。Lonroy［15］用氟化鋁處理胸腺小葉時，亦激起大范圍胸腺細胞亞型的凋亡。Hirano［16］培養骨肉瘤細胞UMR106株，用5 mmol/L氟處理8 h以后，用TUNEL法證明了細胞凋亡的存在。國內學者以大體動物實驗發現過量氟可誘導組織細胞凋亡。呂曉紅［17］在慢性氟中毒大鼠觀察到腦細胞中DAB著染陽性的凋亡細胞，并且表達具有選擇性，流式細胞術顯示慢性氟中毒腦組織中的凋亡峰明顯高于正常對照組。應用流式細胞術同樣檢測到氟中毒大鼠和家兔肝細胞凋亡率較對照組明顯增加［18，19］。實驗中 TUNEL檢測結果顯示：顯微鏡鏡下觀察，對照組細胞核呈現出淡紫色，染毒組細胞核呈現出棕黃色，TUNEL陽性細胞有的胞核略小，有的胞核呈碎片狀。氟中毒組引起大量TUNEL陽性細胞，而對照組大鼠罕見TUNEL陽性細胞。氟可促進睪丸組織細胞的過度凋亡及引起細胞壞死，且細胞凋亡率比同劑量同時間組細胞壞死率高。這提示細胞過度凋亡可能是氟誘發的睪丸組織細胞損傷的主要形式，細胞壞死則是細胞凋亡晚期的表現。氟誘發睪丸組織細胞損傷，可解釋氟可能對睪丸毒作用的機制，即氟通過誘發睪丸組織細胞過度凋亡而對睪丸造成功能性或器質性損害。這也印證了氟對睪丸早期功能性損害的可逆性及晚期結構性改變的不可恢復性。

本研究用病理學觀察、TUNEL的凋亡檢測，證明了氟染毒可導致小鼠睪丸組織細胞凋亡，提示過量氟在體內的毒性和細胞凋亡有關，本結果為深入研究氟的雄性生殖毒性提供了資料。高氟對睪丸組織的損害存在細胞凋亡，其損害過程是一個復雜的過程，細胞凋亡還受到其他多種細胞凋亡基因的調控，如Caspase家族、一氧化氮、興奮性氨基酸、自由基等，各種因素在睪丸間質細胞凋亡的過程發揮怎樣的相互作用，還需開展深入研究。

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