化妝品眼刺激試驗(yàn)替代方法標(biāo)準(zhǔn)化與展望

敖華英，程樹軍，潘 芳，談偉君

（1.廣東出入境檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣州 510623；2.廣東藥學(xué)院，廣州 510310）

化妝品引起的局部眼刺激通常包括結(jié)膜、角膜、虹膜和淚腺的作用，其中角膜的影響排在首位，基于體內(nèi)眼刺激作用發(fā)生的機(jī)制，目前已開發(fā)了多種替代方法，而單一體外實(shí)驗(yàn)僅能模擬復(fù)雜眼損傷作用中的某個方面。因此，有必要根據(jù)角膜損傷的發(fā)生機(jī)制，結(jié)合體外方法的原理和標(biāo)準(zhǔn)化應(yīng)用程度，對目前眼刺激試驗(yàn)的諸多替代方法進(jìn)行科學(xué)相關(guān)性分析與適用性綜述，為建立分層組合的替代方法策略奠定基礎(chǔ)，以滿足實(shí)際工作的需要。

1 眼刺激實(shí)驗(yàn)替代方法的原理和分類

眼刺激作用的發(fā)生是結(jié)膜、角膜、虹膜和淚腺等眼球結(jié)構(gòu)共同參與的過程，其受累范圍反映了眼刺激作用的嚴(yán)重程度。化學(xué)物對結(jié)膜的輕微刺激作用很少累及角膜，而繼發(fā)于角膜損傷引起的結(jié)膜反應(yīng)通常是中等程度以上的刺激性。基于大量化學(xué)物質(zhì)體內(nèi)眼刺激的實(shí)驗(yàn)觀察表明，受試物暴露后最初幾小時內(nèi)（一般3 h）角膜的損傷程度決定了眼睛損傷的持續(xù)時間和最終損害程度。一般來說，輕度刺激物只影響表層角膜上皮，輕度和中度刺激物主要影響上皮和表層基質(zhì)，嚴(yán)重刺激物能穿透更深的基質(zhì)發(fā)揮作用，甚至可能是損傷基質(zhì)全部。有些遲發(fā)性化學(xué)物質(zhì)（例如漂白劑）有可能在暴露1天后才造成深度損傷。角膜損傷程度與大體組織評分結(jié)果基本一致，而且損傷的可逆性和最初的損傷程度相關(guān)。體內(nèi)眼刺激評分同樣是按照角膜、結(jié)膜和虹膜損傷權(quán)重依次降低的關(guān)系建立評價方案，這一原理是開發(fā)和驗(yàn)證眼刺激替代方法的基礎(chǔ)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)體系的不同，目前建立的眼刺激作用替代模型可概括為細(xì)胞功能模型、類器官模型、重建人角膜模型和離體器官模型4類［1］。

2 眼刺激實(shí)驗(yàn)替代方法的標(biāo)準(zhǔn)化

2.1 離體器官替代方法

牛角膜混濁和滲透性實(shí)驗(yàn)（bovine corneal opacity and permeability，BCOP）是2009年被 OECD指南437認(rèn)可的一種離體器官方法。牛角膜取自屠宰場廢棄牛眼，將角膜固定于特制挾持器提供的正常生理環(huán)境中，角膜分隔夾持器為前后兩室，將被測物作用于前室角膜上皮表面一段時間后，通過光濁度儀檢測角膜混濁度及滲透性，評價被測物的眼刺激作用，結(jié)合角膜組織病理檢測結(jié)果判斷更準(zhǔn)確。基于相同的原理，利用離體豬角膜開發(fā)了PCOP（porcine corneal opacity and permeability）方法［2］。目前認(rèn)為BCOP低估了受試物對虹膜和結(jié)膜的刺激作用，因而適于區(qū)分中等到重度眼刺激性物質(zhì)，對于輕度及以下刺激物區(qū)分不夠敏感（表1）。BCOP適用于不同物理性狀和溶解性差異較大的液體和固體受試物，如表面活性劑原料和配方、個人護(hù)理用品和其它化妝品，也適用于化學(xué)品、藥品和農(nóng)藥的眼刺激分類［3］。

離體雞眼實(shí)驗(yàn)（isolated chicken eye test，ICE）是2009年被OECD指南438認(rèn)可的一種替代方法，利用短期離體培養(yǎng)的雞眼球進(jìn)行眼刺激檢測。取雞眼球固定于夾持器，暴露受試物，通過肉眼檢查、測量角膜厚度、表面灌流和熒光素滲透評價角膜損傷程度。以角膜水腫、透光值和熒光素滯留的數(shù)值作為毒理學(xué)終點(diǎn)，以平均最大分值計(jì)算刺激指數(shù)，對眼刺激物的嚴(yán)重程度進(jìn)行分類，結(jié)合組織病理檢測有助于結(jié)果的準(zhǔn)確判斷。ICE實(shí)驗(yàn)的陽性結(jié)果可直接用于眼腐蝕性和嚴(yán)重刺激性分類，陰性結(jié)果不能作為區(qū)分刺激物和非刺激物的確認(rèn)試驗(yàn)，需補(bǔ)充其它體外方法。適用于 ICE檢測的化學(xué)物多為可溶性液體，如表面活性劑和凝膠，對固體物質(zhì)的測試效果不理想［1］。

離體兔眼實(shí)驗(yàn)（isolated rabbit eye test，IRE）是從人道處死的實(shí)驗(yàn)兔分離完整眼球，固定于特定容器中，保持溫濕度的同時，通過受試物與離體兔眼球的直接作用，檢測角膜透光值（角膜通透性）和厚度（角膜腫脹）程度評價受試物眼刺激性。通過不同暴露時間和觀察指標(biāo)的組合分析可對受試物的總體損傷做出評估。通常導(dǎo)致角膜水腫超過15％的化學(xué)物可認(rèn)為具有嚴(yán)重眼刺激性。目前認(rèn)為IRE實(shí)驗(yàn)主要用于預(yù)測角膜損傷，不能用于評估受試物對結(jié)膜的作用或角膜損傷后的恢復(fù)作用。適用檢測中等到嚴(yán)重程度的刺激性物質(zhì)，結(jié)合角膜組織學(xué)檢查可提高預(yù)測能力。該方法對堿性物質(zhì)、陰離子和陽離子表面活性劑、化妝品成分和化學(xué)物質(zhì)較敏感，對固體物質(zhì)不敏感［4］。

2.2 類器官替代方法

雞胚絨毛膜尿囊膜實(shí)驗(yàn)（HET-CAM）是利用雞胚絨毛膜尿囊膜結(jié)構(gòu)與人結(jié)膜相似的特點(diǎn)開發(fā)的替代方法，HET-CAM試驗(yàn)主要測定3種反應(yīng)，即出血、血管溶解和凝血，受試物直接接觸CAM膜，于5 min內(nèi)評價上述三種指標(biāo)的發(fā)生情況。預(yù)測模型可采用反應(yīng)時間法（即測定每一種反應(yīng)終點(diǎn)出現(xiàn)的時間）或刺激閾值法（即測定導(dǎo)致上述毒性終點(diǎn)發(fā)生的受試物濃度）。HET-CAM實(shí)驗(yàn)的結(jié)果觀察易受操作者主觀因素影響，難以量化，改進(jìn)后的絨毛膜尿囊膜苔盼藍(lán)染色試驗(yàn)（chicken chorioallantoic membrane-trypan blue staining，CAM-TB），通過測定CAM吸收臺盼藍(lán)的量來檢測受試物損傷作用，提高了實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性。HET-CAM主要適用于無刺激到輕度刺激物的預(yù)測或篩選，對中度以上的刺激物應(yīng)補(bǔ)充其它實(shí)驗(yàn)確認(rèn)。適合HET-CAM檢測的化合物包括多種類型液體原料和產(chǎn)品，特別適用于表面活性劑和表面活性劑配方。對固體、不溶性或粘稠物質(zhì)的測試重復(fù)性較差，色素和染料測試應(yīng)慎重［5］。

絨毛 膜 尿 囊 膜 血 管 試 驗(yàn) （chorioallantoic membrane vascular assay，CAMVA）試驗(yàn)是簡化了的HET-CAM方法，只觀察受試物暴露CAM 30 min后血管的變化（出血、血管溶解和凝血），計(jì)算使50％的雞胚出現(xiàn)上述損傷的受試物濃度。CAMVA法適用于輕度到中度眼刺激性化合物的檢測，也可正確區(qū)分刺激物和非刺激物，但不能用于嚴(yán)重刺激性物質(zhì)的分類。適于檢測物質(zhì)的類型同 HETCAM法［1］。

蛞蝓粘膜刺激實(shí)驗(yàn)（slugmucosal irritation，SMI）以低等生物蛞蝓作為受試材料，利用其體表粘膜受到刺激后會釋放粘液和分泌物的特點(diǎn)模擬眼球結(jié)膜和角膜的功能，通過對分泌的粘液量、乳酸脫氫酶、蛋白質(zhì)和堿性磷酸鹽的測定評估被測物的刺激性。該方法可以區(qū)分無刺激和刺激性物質(zhì)，適用于檢測表面活性劑、酯、醇、酮及混合物，以及黏性粉狀配方的安全評價。

2.3 重組人角膜組織模型（human corneal epitheliummodels，HCE）

EpiOcular模型是美國MatTek公司生產(chǎn)，由來源于正常人的表皮角質(zhì)細(xì)胞生長于嵌入式細(xì)胞培養(yǎng)板以無血清培養(yǎng)基制備而成，細(xì)胞分化形成的多層結(jié)構(gòu)與角膜上皮相似。EpiOcular試驗(yàn)的測試終點(diǎn)主要是MTT檢測得到ET50（組織活性降低50％的有效暴露時間），還包括IL-1a、PGE2、LDH和鈉熒光素滲透性檢測。SkinEthicTMHCE模型由法國SkinEthic實(shí)驗(yàn)室開發(fā)，在聚碳酸酯膜上按種人角膜上皮細(xì)胞（HCT細(xì)胞系），氣-液界面培養(yǎng)形成由多層上皮細(xì)胞組成的與人眼角膜粘膜類似的重建組織。角膜上皮短時接觸被測物后，采用MTT法或LDH釋放測定組織活性，或測定細(xì)胞因子（例如，IL-1a、IL-6、IL-8、PGE2）定量釋放和基因表達(dá)，標(biāo)準(zhǔn)化測試指標(biāo)是ET50。這兩種角膜模型已商品化供應(yīng)［6-7］。

HCE模型適用于檢測輕微到中度范圍內(nèi)的眼刺激物，還可用于區(qū)分高中度和嚴(yán)重刺激物。適用于各類物理性質(zhì)的化合物測試，在化妝品工業(yè)中，用于確定受試物的毒性限量（如測定輕微作用水平劑量），或用于產(chǎn)品配方階段的臨床前安全性試驗(yàn)，以及用于配方比較和優(yōu)化等（表1）。

2.4 基于細(xì)胞功能的替代方法

中性紅攝取（NRU）或釋放（NRR）試驗(yàn)：利用活細(xì)胞能攝取中性紅染料的特性，可開發(fā)基于中性紅染料攝取或釋放的檢測方法，前者是先將細(xì)胞與受試物作用，通過定量測定染料的攝取量反應(yīng)細(xì)胞的活性；后者是先將活細(xì)胞用染料負(fù)載后再與受試物作用，通過死亡細(xì)胞釋放出的染料間接反應(yīng)細(xì)胞的活性。多種原代細(xì)胞和細(xì)胞系均可用于實(shí)驗(yàn)，如中國倉鼠V79、CHO、3T3 Balb/c和兔角膜細(xì)胞（SIRC系）。NRU在549nm下測定終溶液的光密度值，通過劑量-反應(yīng)曲線得到IC50（使細(xì)胞中性紅攝取能力下降50％的受試物濃度）。NRR在540nm處測定終溶液的光密度，通過劑量反應(yīng)曲線計(jì)算NRR50（使細(xì)胞中性紅釋放下降50％的受試物濃度）。兩個實(shí)驗(yàn)的終點(diǎn)均容易測量，操作簡單、快速、重復(fù)性好，可以定量評估化合物潛在的角膜損傷能力。適用于溫和眼刺激性物質(zhì)的篩查，適用于大多數(shù)液體溶解性物質(zhì)，特別是表面活性劑。但不合適微溶、高揮發(fā)性、有色物質(zhì)或固體物質(zhì)的測試［1］。

紅細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)（red blood cell haemolysis test，RBC）采用化合物與哺乳動物紅細(xì)胞直接接觸，通過定量檢測紅細(xì)胞溶血，以及釋放出細(xì)胞外的血紅蛋白變性程度，模擬角膜的損傷作用。與其他細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和商品化角膜模型相比，RBC實(shí)驗(yàn)成本低廉且快速，與HET-CAM實(shí)驗(yàn)相關(guān)性良好，適用于區(qū)分極輕度和非輕度刺激物，特別是潛在急性眼刺激性物質(zhì)的快速篩查。檢測物質(zhì)類型包括表面活性劑及相關(guān)產(chǎn)品［8］。

熒光素漏出實(shí)驗(yàn)（fluorescein leakage，F(xiàn)L）采用單層上皮細(xì)胞培養(yǎng)形成的緊密連接模擬角膜上皮細(xì)胞的屏障功能，通過檢測緊密連接和橋粒受損后發(fā)生的熒光素漏出量，判斷化合物是否具有眼刺激性。被測物濃度引起20％的熒光素漏出（FL20）的值可用于評估被測物潛在眼刺激性。FL實(shí)驗(yàn)適用檢測輕度到中等眼刺激性物質(zhì)，適合于表面活性劑及相關(guān)物質(zhì)、醇的檢測［1］。

細(xì)胞傳感器實(shí)驗(yàn)（silicon Microphysiometer，SM）是基于細(xì)胞代謝活性改變的實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)的細(xì)胞會釋放酸性代謝物，使培養(yǎng)基pH值下降，進(jìn)而引發(fā)硅膜感受器表面電位改變，試驗(yàn)前先檢測細(xì)胞基礎(chǔ)代謝率，然后不斷逐漸增加被測物濃度，通過間接測量細(xì)胞外pH值的變化檢測代謝率的改變。計(jì)算MRD50（使細(xì)胞代謝率減少50％的受試物劑量）判斷被測物的潛在眼刺激性。SM已通過ECVAM的三期驗(yàn)證，常用于至上而下的眼刺激組合策略的一部分，用于檢測腐蝕性和嚴(yán)重眼刺激性化合物。適用于水溶性化合物的測試（表1）。

表1 眼刺激替代方法Tab.1 Alternativemethods to eye irritation

3 眼刺激實(shí)驗(yàn)替代方法展望

3.1 現(xiàn)有方法的優(yōu)化和標(biāo)準(zhǔn)化

除了法規(guī)認(rèn)可的4項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)化替代方法外，多數(shù)方法處于前驗(yàn)證研究階段，其中重建人工角膜模型是最具前景的替代方法。基于體外皮膚模型已于2010年被OECD認(rèn)可為替代皮膚刺激試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法，角膜模型有望2年內(nèi)通過驗(yàn)證。現(xiàn)有的2種模型分別是來自歐洲 SkinEthic公司和美國MatTek公司，兩者所用細(xì)胞來源不同，因此需要優(yōu)化方法和統(tǒng)一SOP，還需要增加檢測終點(diǎn)以提高預(yù)測能力，如對屏障功能的影響有助于區(qū)分非刺激性和輕微刺激性物質(zhì)［6-7］。

3.2 新替代方法的研發(fā)

現(xiàn)有體外方法不能預(yù)測化合物對組織修復(fù)能力的損傷，也無法檢測組織損傷后的修復(fù)能力，新方法的研發(fā)基于以下幾點(diǎn)：①離體角膜維持培養(yǎng)模型，觀察化學(xué)物暴露后角膜的損傷及修復(fù)，研究離體角膜生理動力學(xué)功能改變和損傷后信號的釋放用于預(yù)測化學(xué)物眼損傷及修復(fù)機(jī)制［9］；②建立含上皮、基質(zhì)和內(nèi)皮的多層角膜模型，以了解化合物對角膜損傷程度和修復(fù)質(zhì)量的預(yù)測，體外重建結(jié)膜模型也是重要方向；③運(yùn)用基因組學(xué)技術(shù)，采用模式識別等方法建立反映角膜損傷和修復(fù)的新終點(diǎn)。

3.3 非生物預(yù)測模型

由于眼刺激生物學(xué)機(jī)制的復(fù)雜性，建立計(jì)算機(jī)模型非常困難，現(xiàn)有模型多數(shù)是對眼刺激生理學(xué)作用的模擬，如滲透作用或腐蝕性。這些模型包括：經(jīng)典的定量模型；分類模型；分子-膜相互作用模型；采用非線性QSAR技術(shù)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型和專家系統(tǒng)（如TOPKAT、BfR的風(fēng)險決策樹）。其中德國風(fēng)險評估研究所開發(fā)的決策支持系統(tǒng)已進(jìn)入ECVAM的驗(yàn)證程序［10］。另外一項(xiàng)可用于眼刺激替代方法研究的是毒理學(xué)相關(guān)閾值法（TTC），它建立在對現(xiàn)有大量化學(xué)物質(zhì)毒性資料分析的基礎(chǔ)上，利用大多數(shù)已知化學(xué)物的暴露閾值，評估類似新物質(zhì)的危害，但用于眼刺激的研究還不多見。

4 體外方法分層組合策略

將現(xiàn)有的不同預(yù)測能力和適用范圍的體外方法組合建立整合策略，是替代眼刺激動物實(shí)驗(yàn)的理想模式［11-12］，即使今后有新的方法開發(fā)和通過驗(yàn)證，也只能是減少組合的方法數(shù)量和提高整合方法的預(yù)測能力。不同方法的組合應(yīng)建立在對現(xiàn)有方法的技術(shù)原理和適用范圍科學(xué)分析的基礎(chǔ)上，并應(yīng)考慮：①建立科學(xué)合理的化妝品眼刺激替代的整合策略；②整合方法如何用于風(fēng)險評估和安全評價；③整合方法的科學(xué)性如何驗(yàn)證；④對不同劑型的化妝品原料和產(chǎn)品進(jìn)行逐類分析，如乳液類、彩妝類、粉餅類、膏霜類等；⑤考慮化妝品以外的其它化合物或新物質(zhì)的評價，如農(nóng)藥、納米材料、醫(yī)療器械等［12-13］。

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