卡貝縮宮素和D型改良縮宮素在促人MG－63細(xì)胞增殖方面與天然縮宮素活性的比較

錢 明 段蒙娜 曲 進(jìn) 劉 敏 (吉林大學(xué)口腔醫(yī)院修復(fù)科，吉林 長春 130021)

卡貝縮宮素和D型改良縮宮素在促人MG－63細(xì)胞增殖方面與天然縮宮素活性的比較

錢 明 段蒙娜 曲 進(jìn) 劉 敏 (吉林大學(xué)口腔醫(yī)院修復(fù)科，吉林 長春 130021)

目的 比較卡貝縮宮素和D型改良縮宮素兩種縮宮素替代物在促人骨肉瘤細(xì)胞系MG－63增殖方面的效果與天然縮宮素是否存在差異。方法 用含兩種縮宮素替代物10、50、100、200 nmol/L的培養(yǎng)基孵育MG－63細(xì)胞5 d，用MTT法檢測細(xì)胞增殖活力的變化，設(shè)空白對照組。同時(shí)以最低有效濃度50 nmol/L縮宮素作為標(biāo)準(zhǔn)組，比較兩種縮宮素替代物在促M(fèi)G－63增殖方面是否具有與縮宮素相同的生物活性。結(jié)果 D型改良縮宮素各濃度組與空白對照組相比無顯著性差異(P＞0.05);100 nmol/L和200 nmol/L卡貝縮宮素組與空白對照組相比有顯著性差異(P＜0.05);100 nmol/L卡貝縮宮素組與50 nmol/L縮宮素組比較無顯著性差異(P＞0.05)。結(jié)論 卡貝縮宮素在促進(jìn)MG－63細(xì)胞增殖方面具有與縮宮素相同的生物活性;D型改良縮宮素的生物活性卻大大減弱。

縮宮素;卡貝縮宮素;D型改良縮宮素

縮宮素(oxytocin)是一種G蛋白耦聯(lián)受體激動劑，在成骨細(xì)胞和其前體骨髓間充質(zhì)細(xì)胞、脂肪間充質(zhì)細(xì)胞表面都存在縮宮素相關(guān)的G蛋白耦聯(lián)受體。目前，國內(nèi)外研究已表明了其在全身應(yīng)用治療骨質(zhì)疏松和局部應(yīng)用促進(jìn)骨缺損愈合方面的廣闊前景〔1，2〕。局部應(yīng)用藥物促進(jìn)骨缺損愈合需要克服的問題是如何使藥物長效作用，而常用的解決方法包括使用緩釋載體和延長藥物半衰期。縮宮素在體內(nèi)通過肝、腎代謝，被血液中的細(xì)胞色素P450單胺氧化酶識別和降解，半衰期僅有4 min左右。卡貝縮宮素是一種人工合成的縮宮素類似物，在血液中有較長的半衰期，目前僅在產(chǎn)科領(lǐng)域應(yīng)用，有與縮宮素相近的作用，促進(jìn)平滑肌收縮。D型改良縮宮素是用D型氨基酸合成的、與天然縮宮素呈手性對稱的對映體，同樣具有逃避細(xì)胞色素P450單胺氧化酶識別、延長半衰期的作用。本研究以人骨肉瘤細(xì)胞系MG－63為模型，比較兩種縮宮素的替代物在促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖方面是否與天然縮宮素具有同樣的效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 MG－63購自上海細(xì)胞生物研究所;OT購自上海肽仕生物科技有限公司;Carbetocin購自上海吉爾生化有限公司;MTT購自Sigma公司;胎牛血清、低糖DMEM及二甲基亞砜購自杭州四季青公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 臺式高速離心機(jī)(Hermlez323K，美國)，倒置顯微鏡(OLYMPUS，日本)，超凈工作臺(上海醫(yī)療器械廠)，酶標(biāo)儀(Bio－Rad，美國)，ZORBAX Poroshell 300? 液相色譜柱(Agilent，美國)，CO2恒溫培養(yǎng)箱(SANOY，美國)，電子天平(上海生物儀器廠)，無菌手術(shù)器械、細(xì)胞培養(yǎng)管及細(xì)胞培養(yǎng)瓶。

1.2 方法

1.2.1 D型改良縮宮素合成 以Rink MBHA Amide Resin樹脂為載體，采用Fmoc固相合成方法進(jìn)行多肽合成。然后用三氟乙酸從樹脂上剪切，真空冷凍干燥。利用高效液相色譜反相柱技術(shù)分離、純化及制備。利用 Zorbax 300 SB－C8柱子，含0.1%三氟乙酸的水溶液和含0.1%三氟乙酸的乙腈做線性梯度分離，流速為2 ml/min，得到高純度D型改良縮宮素，備用。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定 用含15%小牛血清的F12培養(yǎng)基、5%CO2全濕度、37℃條件下孵育MG－63細(xì)胞，12 h細(xì)胞貼壁，每間隔2 d換液，3 d后細(xì)胞生長良好，呈長梭型，折光性良好、邊界清晰。7 d后細(xì)胞融合達(dá)80%，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，0.25%胰酶消化，1∶2傳代。至傳3代后生長穩(wěn)定，備用。

1.2.3 MTT檢測兩種縮宮素替代藥物對MG－63細(xì)胞增殖的影響 將處于對數(shù)期生長的MG－63細(xì)胞用0.25%胰酶消化，15%小牛血清的F12培養(yǎng)基終止消化。通過細(xì)胞計(jì)數(shù)板將細(xì)胞懸液調(diào)整至2.5×104/m l。取96孔板加樣200μl，5%CO2全濕度、37℃條件下孵育24 h至細(xì)胞貼壁。卡貝縮宮素和D型改良縮宮素分別設(shè)10、50、100、200 nmol/L四個(gè)梯度;另設(shè)空白對照，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，孵育時(shí)間5 d。每孔加噻唑藍(lán)20μl，4 h后取出原液，加入DMSO 150μl，搖床振蕩15min，在酶標(biāo)儀490 nm波長下測量各孔的吸光度。

1.2.4 兩種替代藥物與縮宮素作用效果的比較 將50 nmol/L作為縮宮素的最低有效濃度，作用于MG－63細(xì)胞系5 d，MTT法檢測其A值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

卡貝縮宮素組隨著藥物濃度的增加，A值逐漸升高，表現(xiàn)出劑量依賴性，當(dāng)濃度超過100 nmol/L時(shí)與空白對照組(0.687±0.015)有顯著性差異。D型改良縮宮素組A值隨藥物濃度變化不明顯，各濃度梯度與空白對照組未見顯著性差異。50 nmol/L濃度縮宮素組A值為0.816±0.025，與對照組比較有顯著性差異。不同濃度卡貝縮宮素及D型改良縮宮素組A值比較，卡貝縮宮素在促進(jìn)MG－63細(xì)胞增殖方面與縮宮素具有相近的效果，而D型改良縮宮素在促進(jìn)MG－63細(xì)胞增殖方面沒有明顯效果。見表1。

表1 不同濃度卡貝縮宮素以及D型改良縮宮素作用于MG-63細(xì)胞5 d時(shí)A值的變化(±s)

表1 不同濃度卡貝縮宮素以及D型改良縮宮素作用于MG-63細(xì)胞5 d時(shí)A值的變化(±s)

與10 nmol/L比較:1)P＜0.05

10 nmol/L 50 nmol/L 100 nmol/L 200 nmol/L卡貝縮宮素組 0.695±0.017 0.760±0.021 0.820±0.0191) 0.871±0.0161)組別0.013 D型改良縮宮素組 0.702±0.019 0.704±0.010 0.710±0.015 0.721±

3 討論

卡貝縮宮素和D型改良縮宮素是為了克服縮宮素體內(nèi)半衰期短、容易被細(xì)胞色素P450單胺氧化酶識別和降解的副作用而使用的替代性藥物。兩種藥物通過不同的機(jī)制能夠有效延長其在體內(nèi)的半衰期〔3〕，但通過本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，卡貝縮宮素在促進(jìn)MG－63細(xì)胞增殖方面仍具有與縮宮素相同的生物活性，但D型改良縮宮素的生物活性卻大大減弱。

D型改良縮宮素是通過人工合成得到的與縮宮素呈鏡像對稱的手性對映體。受體與配體的識別具有高度空間特異性，即配體表面a、b、c三個(gè)基團(tuán)與配體表面X、Y、Z活性作用點(diǎn)結(jié)合才表現(xiàn)出較高的活性〔4〕。D型改良縮宮素雖然通過改變空間結(jié)構(gòu)逃避體內(nèi)特異性酶的識別延長了半衰期，但可能正是因?yàn)榭臻g構(gòu)象發(fā)生了改變，使三個(gè)特異性位點(diǎn)中只有兩個(gè)能夠結(jié)合，降低了與細(xì)胞表面功能性受體的結(jié)合能力。這就可以解釋D型改良縮宮素?zé)o法有效促進(jìn)MG－63細(xì)胞增殖的原因。

卡貝縮宮素與縮宮素相似，同樣由9個(gè)氨基酸組成。縮宮素肽鏈中位于1、6位的半胱氨酸之間形成二硫鍵，二硫鍵是蛋白質(zhì)二三級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定中心，也是體內(nèi)細(xì)胞色素P450單胺氧化酶識別和降解的位點(diǎn)。而卡貝縮宮素則是由－CH2－CH2－SCH2－結(jié)構(gòu)替代了縮宮素1、6位半胱氨酸間的二硫鍵，所以在體內(nèi)的半衰期能夠延長10倍以上。但卡貝縮宮素中各活性基團(tuán)的空間位置與縮宮素基本一致，所以對MG－63細(xì)胞表面的功能性受體仍具有高度的特異性，表現(xiàn)出與縮宮素一樣的高活性〔5〕。

綜上所述，卡貝縮宮素是一種在調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞增殖方面與縮宮素具有相似作用的人工合成藥物，且具有體內(nèi)半衰期較長的特點(diǎn)，在局部應(yīng)用縮宮素調(diào)節(jié)骨代謝、促進(jìn)骨缺損愈合的過程中可以作為縮宮素的替代藥物使用。

1 Tamma R，Colaianni G，Zhu LL，et al.Oxytocin is an anabolic bone hormone〔J〕.Proc Natl Acad Sci U SA，2009;106(17):7149－54.

2 Elabd C，Basillais A，Beaupied H，et al.Oxytocin controls differentiation of human mesenchymal stem cells and reverses osteoporosis〔J〕.Stem Cells，2008;26(9):2399－407.

3 Sclafani A，Rinaman L，Vollmer RR，et al.Oxytocin knockoutmice demonstrate enhanced intake of sweet and nonsweet carbohydrate solutions〔J〕.Am JPhysiol Regul Integr Comp Physiol，2007;292(8):1828－33.

4 Elabd SK，Sabry I，Hassan WB，etal.Possible neuroendocrine role for oxytocin in bone remodeling〔J〕.Endocr Regul，2007;41(4):131－41.

5 Elabd C，Basillais A，Beaupled H，et al.Oxytocin controls differentiation of human mesenchymal stem cells and reverses osteoporosis〔J〕.Stem Cells，2008;26(9):2399－407.

R71

A

1005-9202(2012)16-3473-02;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.16.058

吉林省科技廳自然科學(xué)基金資助課題(No.200705195);吉林大學(xué)博士研究生交叉學(xué)科科研資助項(xiàng)目(No.450091102521)

劉 敏(1973－)，女，主治醫(yī)師，碩士，主要從事硬組織代謝及骨替代材料研究。

錢 明(1981－)，男，醫(yī)師，在讀博士，主要從事硬組織代謝及骨替代材料研究。

〔2012－01－09 收稿 2012－01－19 修回〕

(編輯 袁左鳴)