高壓氧預處理對脊髓損傷后后角神經元的保護作用

李洪鵬，巴方，白丹，高杰

（中國醫科大學1.基礎醫學院解剖教研室，沈陽 110001；2.附屬盛京醫院康復科，沈陽 110006）

高壓氧預處理對脊髓損傷后后角神經元的保護作用

李洪鵬1，巴方2，白丹1，高杰1

（中國醫科大學1.基礎醫學院解剖教研室，沈陽 110001；2.附屬盛京醫院康復科，沈陽 110006）

目的探討高壓氧預處理是否可以通過抑制早期的細胞凋亡來保護脊髓后角神經元。方法 隨機將24只雄性Wistar大鼠分成對照組與高壓氧預處理組。高壓氧預處理組在給予高壓氧5d后與對照組同時制作脊髓（T8～T10）全橫斷模型。術后8h、1d和3d取脊髓做冠狀冰凍切片，行Nissl及TUNEL染色，光鏡下觀察。結果 Nissl染色顯示，術后8h及1d時脊髓后角內濃染的細胞多見，高壓氧預處理組與對照組比較濃染的細胞較少，3d后兩組無明顯差異；TUNEL染色顯示，術后8h及1d時陽性細胞多見，8h時兩組差異明顯（P<0.05），1d時差異最顯著（P<0.01）。結論高壓氧預處理對脊髓損傷后后角神經元起保護作用，術后1d內保護效果明顯。

高壓氧預處理；脊髓損傷；前角運動神經元；凋亡

脊髓損傷后對缺血耐受性較差，缺血缺氧可導致脊髓的二次損傷［1］。Chu等［2］報道缺血缺氧可誘發多種因子引起DNA損傷和修復。高壓氧可提高血液中血紅蛋白的氧飽和度，適度的高壓氧可以預防二次損傷［3］。特別是高壓氧預處理可以提高中樞神經對缺血缺氧的耐受性，進而保護神經元的生存率［4］。然而，既往的研究多停留在脊髓缺血后高壓氧預處理的保護作用，而高壓氧預處理對提高直接的脊髓損傷后神經元的生存率鮮有報道。本研究探討了高壓氧預處理對脊髓損傷后后角神經元的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

選取雄性10周齡SPF級成年Wistar大鼠，體質量230～280g，平均250g，由中國醫科大學實驗動物中心提供。實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學標準。24只大鼠隨機分成高壓氧預處理組和對照組，每組12只。

1.2 方法

1.2.1 高壓氧預處理：將高壓氧預處理組動物置入NGT50B型鋼制實驗動物高壓艙（NGT50B型，煙臺宏遠高壓氧艙制造有限公司）內，以含98%O2、2%CO2的混合氣體連續洗艙10min，使艙內氧濃度達90%以上。再以34.5kPa/min的加壓速率，在20min內勻速加壓至0.15MPa，穩壓60min，中間用加壓用混合氣體通風2次，每次5min，艙內氧濃度為98%～100%，相對濕度為60%～80%，溫度37℃。高壓氧預處理后20min內勻速減壓出艙。治療每天1次，連續治療5d，最后一次處理后24h內與對照組動物同時造模。

1.2.2 脊髓損傷模型制備：兩組大鼠用10%水合氯醛（3mL/kg）腹腔注射，麻醉后俯臥位固定，在約T8～T10水平做后正中切口，逐層切開組織，暴露T9～T10棘突，咬除棘突和椎板暴露脊髓，在T9～T10之間用鋒利手術刀片行脊髓全橫切，以鼠產生翹尾反應為成功標準。生理鹽水沖洗后曬少許青霉素粉，逐層縫合。術后大鼠自由進水進食，分籠清潔飼養。

1.2.3 動物標本制備：大鼠分別在術后8h、1d和3d用10%水合氯醛（3mL/kg）腹腔注射麻醉后行灌流固定，生理鹽水快速灌流后再快速灌流4%多聚甲醛（300mL）。切取以橫斷處為中心上方1.0cm長的脊髓組織，浸于4%多聚甲醛后固定24h，轉入30%蔗糖溶液24h，OCT包埋后以脊髓橫斷端為起始做10μm厚的連續冠狀冰凍切片，切片以備染色使用。

1.2.4 Nissl染色：切片經0.02mol/L PBS沖洗3次后，在0.1%甲酚紫染色液中染色15min，再經乙醇梯度快速脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固觀察。

1.2.5 TUNEL染色：試劑盒購自凱基生物，步驟簡述如下：（1）預處理：冰凍切片經固定液、封閉液（3%H2O2溶于甲醇）以及浸入通透液（0.1%TritonX-100溶于0.1%檸檬酸鈉）等前處理。（2）標記反應：切片經 TdT 酶反應液（45μL Equilibration Buffer+1μL Biotin-11-dUTP+4μL TdT Enzyme）、Streptavidin-HRP 工 作 液 （0.5μL Strepavidin-HRP+99.5μL PBS） 及 DAB 工作液 （5μL 20×DAB+1μL 30%H2O2+94μL PBS），室溫顯色反應 10min。切片同樣經乙醇梯度快速脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固觀察。光學顯微鏡下觀察并用圖像分析儀（Meta Morph/OP10/BX41，OLYMPUS，日本）拍片。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 Nissl染色結果

脊髓后角細胞染色中多數細胞核仁清晰可見。術后8h時高壓氧預處理組（圖1A）與對照組（圖1B）相比濃染的細胞（箭頭所示）較少；1d后濃染的細胞較8h增加明顯，而對照組（圖1D）與高壓氧預處理組（圖1C）相比濃染細胞增加更明顯，且有類似腫脹細胞出現（箭頭所示）；3d后兩組濃染的細胞（圖 1E，F）均減少。

2.2 TUNEL染色結果

術后8h～1d，兩組的脊髓前角內均可見大量的細胞核陽性反應。術后8h時高壓氧預處理組（圖2A）與對照組（圖2B）相比陽性反應細胞（箭頭所示）略少；1d后兩組陽性細胞增加明顯，高壓氧預處理組（圖2C）與對照組（圖2D）比較陽性反應細胞（箭頭所示）明顯減少；3d后兩組均見極少量陽性細胞（圖 2E，F）。

2.3 各時間點凋亡細胞數

對兩組3個時間段的后角內凋亡細胞進行計數統計，每個標本取4張切片的同等大小的視野觀察陽性細胞取平均值。8h、1d和3d時對照組的后角TUNEL染色陽性細胞的平均值分別為24.5±4.5、62.5±6.5和4.5±1.5，高壓氧預處理組分別為18.5±5.5、42.5±5.5和 4.0±0.5。脊髓損傷后 8h，對照組與高壓氧預處理組相比差異有統計學意義（P<0.05）；脊髓損傷后1d，對照組與高壓氧預處理組相比差異顯著（P<0.01）；脊髓損傷后3d，對照組與高壓氧預處理組相比差異無統計學意義（P>0.05）。

3 討論

本研究證明了高壓氧預處理可以在脊髓損傷后的短期內提高脊髓后角細胞的生存率，說明高壓氧預處理可以對后角神經元起到保護作用。既往研究提示，脊髓損傷后給予高壓氧治療可以提高神經元的生存率，并解釋為高壓氧治療的效果可能與減弱誘導型一氧化氮合成酶基因表達有關［5］。Sakurai等［6］報道運動神經元在脊髓缺血后8h運動神經元顯示膠質細胞源性神經營養因子陽性，海馬則在腦缺血后3h即顯示膠質細胞源性神經營養因子陽性［7］，而膠質細胞源性神經營養因子被認為是抑制細胞凋亡的重要因子之一。高壓氧預處理常常被應用于脊髓缺血的動物模型，在兔的脊髓缺血模型中，脊髓缺血15min后脊髓內的凋亡細胞產生于術后1d［8］。有學者認為脊髓缺血后細胞凋亡主要發生在24h內，其發生機制與線粒體對缺血再灌注的調節相關［9］。在缺血再灌注過程中，活性氧自由基的大量產生可導致線粒體內膜的腺嘌呤核苷酸移位酶的氧化巰基釋放而導致其通透性增加［10］，從而導致細胞的崩解和凋亡。早期的研究顯示高壓氧預處理可上調超氧化物歧化酶及過氧化氫酶的活性［11］，由此可以認為本研究中對后角神經元的保護作用可能同樣是由上述原因造成的。由于脊髓全橫斷后同樣會切斷供應脊髓的血管，因此損傷區域產生與脊髓缺血同樣的結果是可以理解的。高壓氧預處理可以減輕脊髓損傷后數小時內產生的氧化應激反應，而氧化應激反應和免疫反應是產生脊髓損傷后二次損傷的主要因素。因此，我們認為高壓氧預處理對神經元的保護作用與降低氧化應激反應有關，并且保護作用主要體現在脊髓損傷后的3d以內。

高壓氧預處理對神經元的保護機制還不甚明了。但在脊髓缺血模型中，高壓氧預處理可能通過提高細胞內的超氧化物歧化酶來抑制細胞內線粒體等的崩解，進而提高神經元的生存率［4］。在本研究的脊髓損傷模型中我們發現，高壓氧預處理同樣在類似的時間段內起到相同的神經元保護作用。因此我們推測，高壓氧預處理保護脊髓損傷后的神經元的機理同樣與提高超氧化物歧化酶有關，關于血中及組織的超氧化物歧化酶值的變化有待于進一步的研究。

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（編輯陳 姜，英文編輯劉寶林）

Spinal Cord Posterior Horn Neurons are Protected by Hyperbaric Oxygen Preconditioning after Spinal Cord Injury

LI Hong-peng1，BA Fang2，BAI Dan1，GAO Jie1
（1.Department of Human Anatomy，College of Basic Medical Sciences，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.Department of Rehabilitation，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110006，China）

ObjectiveTo test the hypothesis that spinal cord posterior horn neurons are protected by hyperbaric oxygen preconditioning（HBO-PC）and mediated by inhibition of early apoptosis.Methods24Wistar male rats were randomly divided into 2groups：control group and HBO-PC group.The rats in HBO-PC group were administrated HBO for 5d，their spinal cords （T8-T10）were all transected as same as the control group.At 8h，1d and 3d after operation，the spinal cords were cut for coronal frozen sections，and the sections were stained with Nissl and TUNEL staining，they were observed by light microscope and analyzed by statistics.ResultsNissl staining demonstrated that the hyperchromic cells were found in posterior horn neurons in two groups at 8h and 1d after operation，the hyperchromic cells were lesser in HBO-PC group than that of control group，no big difference between two groups at 3d postoperative；TUNEL staining demonstrated that the positive cells were most found in posterior horn neurons at 8h and 1d after the operation，there were difference between two groups at 3d postoperative.Statistic analysis demonstrated that the difference was obvious at 8h（P<0.05）and significant at 1d（P<0.01）postoperative，respectively.ConclusionTheResultsdemonstrated that HBO-PC could protect posterior horn neurons after spinal cord injury，the effects were shown most significant within 1d after spinal cord injury.

hyperbaric oxygen preconditioning；spinal cord injury；posterior horn neuron；apoptosis

R322.8

A

0258-4646（2012）01-0011-04

doiCNKI：21-1227/R.20120113.1027.024

http：//www.cnki.net/kcms/detail/21.1227.R.20120113.1027.024.html

國家自然科學基金資助項目（30872669）

李洪鵬（1966-），男，副教授，博士.E-mail：lihongpeng1966@hotmail.com

2011-10-25

網絡出版時間：2012-01-1310：27