缺血再灌注大鼠腦表超氧陰離子產生的可視化檢測

王勇，王春霞，姚長義，王運杰

（中國醫科大學1.附屬第一醫院神經外科，沈陽 110001；2.附屬第四醫院眼科，沈陽 110005）

缺血再灌注大鼠腦表超氧陰離子產生的可視化檢測

王勇1，王春霞2，姚長義1，王運杰1

（中國醫科大學1.附屬第一醫院神經外科，沈陽 110001；2.附屬第四醫院眼科，沈陽 110005）

目的對缺血再灌注大鼠腦皮質區域超氧陰離子的產生進行可視化檢測。方法 用MitoSOXTM（超氧陰離子熒光標記探針）標記大鼠腦表區域神經細胞，共焦點激光顯微鏡活體觀察在缺血（10min）再灌注（30min）過程中，腦表區域O2-產生的情況。結果 缺血開始3min后，O2-產生開始增加，并一直持續到再灌注后10min停止增長。結論在缺血期及再灌注早期O2-生成增加，且動脈附近區域O2-產生量要多于其他區域。

缺血再灌注；前腦缺血；氧自由基；活體成像

腦缺血再灌注損傷在臨床上非常多見。大量研究揭示自由基在缺血再灌注損傷機制中扮演著重要角色［1，2］，但此結論多建立在細胞實驗及免疫組化研究等離體實驗的基礎上，關于自由基活體檢測的報道則甚少［3，4］。本研究以SD大鼠為對象，通過4血管阻斷法建立前腦缺血再灌注損傷模型，利用共焦點激光熒光顯微鏡活體觀察自由基產生情況，以期建立一個自由基可視化檢測平臺。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

雄性Sprague-Dawley大鼠13只，9周齡，體質量250～300g，由中國醫科大學實驗動物部提供。將大鼠隨機分為血流測定組（腦組織不染色，只對缺血再灌注腦表腦血流進行測定，n=5），缺血組（腦表腦組織熒光染色后，接受缺血再灌注，n=5）和對照組（腦表腦組織熒光染色后不接受缺血再灌注，n=3）。

1.2 方法

1.2.1 缺血模型制作：采用改良4血管阻斷法（4-vessel occlusion，4-VO）制作大鼠全腦缺血再灌注損傷模型：閉塞兩側椎動脈，雙側頸總動脈安置血管阻斷氣囊，缺血時間10min，再灌注30min，缺血過程中進行體溫、血壓、心率等生命指標監測；缺血前行靜脈血氣分析。

1.2.2 腦血流測定：水合氯醛（400mg/kg）腹腔注射麻醉后，頭架固定大鼠，暴露右側顱骨，于Bregma點后3.6mm、中線旁開2mm處，開1個3mm直徑骨窗，硬膜保持完整。應用激光多普勒血流測定儀（Advance Co Ltd，Tokyo，Japan） 監測腦血流變化情況。

1.2.3 MitoSOXTM腦表活體染色：開顱過程同上，小心剪開硬膜，將MitoSOX（5μmol/L；Invitrogen；Ex/Em=510/580nm）通過顯微注射泵注射至皮層下3mm，注射泵氣壓 0.1bar，推注時間 0.1s［5］，在熒光染劑孵育30min后，用生物膠結合載玻片封閉骨窗，骨窗下用人工腦脊液填充。

1.2.4 O2-分子活體成像：使用的正立顯微鏡（B X50WI，Olympus，Japan）裝配有共焦點掃描系統（CSU-21，Yokogawa，Japan），相機（C2400，Hamamatsu Photonics，Japan）， 信 號 放 大 器（C2400-21SV，Hamamatsu Photonics，Japan），10倍水鏡觀察。缺血前5min開始基線采集，缺血10min，再灌注30min，觀察時間共45min。每30s采集圖像1次，共計 90張。采用 A quaCosmos software（Hamamatsu Photonics，Japan）軟件分析圖像。

1.3 統計學分析

統計學分析軟件為SPSS 10.0，組間比較方法為t檢驗或單因素方差分析，P<0.01為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腦血流測定

缺血組與對照組之間，缺血前血氣結果無差異。4血管被阻斷后，腦表血流量能下降至正常基線的（20±10）%；撤銷阻斷后，腦血流迅速恢復并產生1個一過性過灌注峰［（110±10）%］，過灌注維持 2～3min后，血流再次回復到基線水平（圖1）。

2.2 腦表MitoSOXTM的熒光變化

缺血時，觀測到觀察窗內MitoSOXTM的熒光強度上升到（160±10）%，再灌注時繼續上升至（182±11）%（圖2）。進一步對腦表各個部位進行圖像分析，發現動脈附近區域熒光上升最高為（222±13）%，富含毛細血管床區域為（162±7）%。提示O2-的產生具有部位特異性（圖3）。

3 討論

在缺血再灌注過程中會有大量的自由基產生，進而引發一系列病理變化，最終導致神經細胞功能障礙乃至死亡。但對自由基的檢測一直限于細胞實驗、免疫組化研究等離體實驗水平，活體水平檢測報道甚少。電子自旋共振譜 （electron spin-resonance spectroscopy，ESR）、自旋捕集和微量滲析等技術因操作復雜、費用高昂，普及受限。上述方法均非即時檢測，無法把握穩定性極差的自由基的實際產生［6～8］。鑒于此，本研究擬采用活體成像技術，建立一個自由基可視化檢測平臺。

MitoSOXTM是一種新型的自由基熒光探針，能高效率的滲透過細胞膜，進入線粒體內，高選擇的與O2-超氧陰離子結合，發出紅色熒光。但是與Fluo-2，Fluo-3等鈣離子螯合劑不同，MitoSOXTM被氧化后無法再解離，所以MitoSOXTM熒光增強說明O2-生成增加；MitoSOXTM熒光無變化說明O2-生成無增加。另外，我們采用的是氣動顯微注射染色法，可以使熒光染劑在最短的時間內擴散到皮層腦組織內，減少了孵育時間及熒光褪色。

在活體成像研究中，腦搏動（隨著呼吸、心跳）對圖像采集影響非常大。我們采用了透明閉合骨窗及骨窗下人工腦脊液填充的方法，最大程度地減少了腦搏動，保持觀察范圍內焦點及景深的穩定。通過閉合骨窗的載玻片，光鏡下可以在解剖學上區分動靜脈及毛細血管區，對比熒光像可以對比不同區域的熒光變化。

本研究結果提示，在缺血期及再灌注早期O2-大量產生，這與國內外相關研究結果一致［4，8］。我們利用活體成像技術對腦表不同區域的自由基產生進行了可視化分析，結果提示在動脈周圍區域O2-產生要遠遠多于其他區域。其原因可能是：（1）動脈附近氧濃度高，O2-產生所必需的原料充足；（2）黃嘌呤氧化酶在內皮細胞中大量表達，該酶能促進O2-的形成［9］。

本研究中我們對經典的4-VO法做了部分改良，采用可充氣球囊壓迫頸總動脈代替了以往的尼龍繩牽拉法。有效降低了因術者牽拉尼龍線力度過大而導致血管壁損傷斷裂出血或因牽拉力量不足導致缺血效果不確實等情況的發生。腦血流測定結果也提示改進后的缺血模型在缺血強度上與經典方法接近。

本研究初步確立了一種活體成像自由基檢測新方法，確立了小動物腦組織活體自由基檢測平臺。通過更換熒光探針，對腦表其他信號傳導，如其他自由基、鈣離子變化及膜電位變化等進行可視化檢測，因此具有廣闊的應用前景。

［1］Floyd RA，Carney JM.Free radical damage to protein and DNA：mechanisms involved and relevant observations on brain undergoing oxidative stress［J］.Ann Neurol，1992，32（Suppl）：S22-S27.

［2］Halliwell B.Reactive oxygen species and the central nervous system［J］.J Neurochem，1992，59（5）：1609-1623.

［3］Phillis JW，Sen S.Oxypurinol attenuates hydroxyl radical production during ischemia/reperfusion injury of the rat cerebral cortex：an ESR study［J］.Brain Res，1993，628（1-2）：309-312.

［4］Zini I，Tomasi A，Grimaldi R，et al.Detection of free radicals during brain ischemia and reperfusion by spin trapping and microdialysis［J］.Neurosci Lett，1992，138（2）：279-282.

［5］Stosiek C，Garaschuk O，Holthoff K，et al.In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2003，100（12）：7319-7324.

［6］Tarpey MM，Wink DA，Grisham MB.Methods for detection of reactive metabolites of oxygen and nitrogen：in vitro and in vivo considerations［J］.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2004，286（3）：R431-R444.

［7］Zini I，Tomasi A，Grimaldi R，et al.Detection of free radicals during brain ischemia and reperfusion by spin trapping and microdialysis［J］.Neurosci Lett，1992，138（2）：279-282.

［8］Sakamoto A，Ohnishi ST，Ohnishi T，et al.Relationship between free radical production and lipid peroxidation during ischemia-reperfusion injury in the rat brain［J］.Brain Res，1991，554（1-2）：186-192.

［9］Betz AL.Identification of hypoxanthine transport and xanthine oxidase activity in brain capillaries［J］.J Neurochem，1985.44（2）：574-579.

（編輯王又冬，英文編輯劉寶林）

Superoxide Radical Production in Rat Ischemic Brain Measured by Intravital Fluorescence Imaging

WANG Yong1，WANG Chun-xia2，YAO Chang-yi1，WANG Yun-jie1
（1.Department of Neurosurgery，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.Department of Ophthalmology，The Fourth Affiliated Hospital，China Medical University，Shenyang 110005，China）

ObjectiveWe examined reactive oxygen species （ROS）generation on cerebral ischemia/reperfusion rats by intravital fluorescence imaging.MethodsIn anesthetized adult rats，MitoSOX （a fluorescent dye for superoxide radical） was injected into cortices by a pressurized bolus.Through a closed cranial window，fluorescent images were taken with a confocal microscope on 10-minute forebrain ischemia and 30-min reperfusion.ResultsIn ischemia and the early period of reperfusion，the MitoSOX fluorescence intensity significantly increased to 183%，and these increases were significant in the areas adjacent to the arteries.ConclusionO2-production increased in ischemia and the early period of reperfusion period.The O2-production was location-selective，being significant in the areas adjacent to the arteries.This method was useful for investigating intracellular in situ ROS production.

cerebral ischemia and/or reperfusion；in vivo imaging；oxidative stress

R743.3

A

0258-4646（2012）01-0018-03

doiCNKI：21-1227/R.20120113.1028.026

http：//www.cnki.net/kcms/detail/21.1227.R.20120113.1028.026.html

國家自然科學基金青年科學基金資助項目（81000565/H0914）

王勇（1975-），男，主治醫師，博士.E-mail：wangyong@mail.cmu.edu

2011-07-04

網絡出版時間：2012-01-1310：28