大鼠Walker-256移植性肺癌模型的建立

黃文革，李 婕，陳鳳英，黃河清

（中山大學實驗動物中心，廣州 510080）

肺癌是目前死亡率最高的癌癥之一。建立理想的動物腫瘤模型是研究惡性腫瘤發生、發展、轉移及療效評價的重要手段。其中，可移植腫瘤模型因操作簡便、易于觀察，得到了學者們的廣泛認可。Walker-256是目前廣泛認可的大鼠可移植性腫瘤細胞株，植入體內能較好地模擬人類惡性腫瘤的膨脹性和浸潤生長方式［1］。目前，學者們主要應用Walker-256細胞植入大鼠支氣管［2］，構建原位性肺癌模型。但此造模方法對實驗技術要求較高，術后動物死亡率高，在實際應用中成模率低；而采用尾靜脈注射建立肺癌移植性模型鮮見報道。本研究采用靜脈注射方法建立大鼠Walker-256移植性肺癌模型，觀察大鼠的成瘤及生存情況，為進一步的腫瘤實驗研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

大鼠Walker-256瘤株，由中山大學實驗動物中心細胞庫提供；KM小鼠，4只，體重18～22 g，雄性，SPF級，實驗動物質量合格證明號：No.0084621。SD大鼠40只，體重60～70 g，雄性，SPF級，實驗動物質量合格證明號：No.0084696，均購于中山大學實驗動物中心，生產許可證號：SCXK（粵）2009—0011。動物飼養于標準的屏障環境動物實驗室。實驗動物設施許可證號：SYXK（粵）2007—0081.

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞的復蘇和腹水的制備：Walker-256癌細胞常規復蘇，置于新生小牛血清的RPMI-1640培養液中，低速離心，棄上清液，再用培養液配成細胞懸液（1×107/m L），將細胞懸液接種到KM小鼠腹腔中，0.2 m L/只，5～7 d后出現腹水。

1.2.2 移植性肺癌模型的建立：將KM小鼠的Walker-256細胞腹水，無菌操作，用5 m L一次性注射器（6號針頭）抽出腹水，用生理鹽水稀釋，用細胞計數儀進行計數，再用生理鹽水稀釋成高、中、低三個濃度（分別為1.5×106/m L，0.5×105/m L，2.5× 104/m L）備用。取40只SD大鼠隨機分為高、中、低三個模型組和正常對照組，共4組，每組10只，采用尾靜脈注射接種法，模型組大鼠尾靜脈注射不同濃度的腹水細胞懸液，0.2 mL/只，正常對照組大鼠尾靜脈注射等量的生理鹽水，所有動物飼養在屏障環境動物實驗室中。實驗期間，動物自由飲食；連續觀察21 d。

1.3 觀察指標

1.3.1 大體觀察：觀察注射腹水細胞懸液后大鼠的毛色、體重、飲食、活動情況；當模型組有動物出現死亡時結束實驗觀察，采用頸椎脫臼法處死全部大鼠，對大鼠進行常規解剖，肉眼觀察肺臟及其他器官的大小、色澤、質地及有無腫瘤結節形成，。

1.3.2 取材：稱取各組大鼠的肺部、肝臟、脾臟的重量，計算臟器系數（臟器系數=器官重量/體重×100％）。

1.4 組織病理學分析

所取的大鼠的肺和可疑臟器，用10％福爾馬林固定，常規石蠟包埋，切片厚4～5μm，HE染色，觀察病理形態學變化。

1.5 統計學方法

用SPSS 17.0軟件包處理，數據以xˉ±s表示，組間差異采用方差分析，P＜0.05認為有統計學意義。

2 結果

2.1 動物的一般情況及體重變化

模型組大鼠注射腫瘤腹水細胞懸液后7 d動物飲食、體征正常，14 d后大鼠出現食量明顯減少，活動少，倦怠狀，對外界刺激反應遲鈍，皮毛松、無光澤，體質消瘦等癌癥惡病質體征。注射后7、12、14和21 d，高、中、低三個模型組體重均明顯低于正常對照組（P＜0.05）。注射后21 d高濃度模型組大鼠開始出現死亡。各組大鼠不同時間點的體重情況見表1。

2.2 移植性肺癌模型的成瘤率

注射腫瘤腹水細胞懸液后21 d，高濃度組動物出現死亡，處死所有實驗組大鼠，解剖后肉眼觀察發現高濃度模型組全部動物肺部均出現多個肉眼可見的癌結節（10/10），中濃度組則有8只（8/10），低濃度組中有3只（3/10）出現上述表現，各組移植性肺癌成瘤率見表2。

2.3 各組大鼠臟器系數

高、中、低濃度組大鼠肺臟系數、肝臟系數高于正常對照組，其中高劑量組差異有統計學意義（P＜0.05）；各濃度組大鼠脾臟系數與正常對照組相比無顯著性差異，見表3。

表1 各組動物不同時間點的體重情況（±s） Tab.1 The body weight of the rats at different time

表1 各組動物不同時間點的體重情況（±s） Tab.1 The body weight of the rats at different time

注：與正常對照組相比，＊＊P＜0.01.Note：Compared with the normal group，＊＊P＜0.01

組別Groups 不同時間點體重/克The body weight of the rats at different time/g實驗前Before experiment 7 d 12 d 14 d 21 d正常組Normal group 67.9±5.3 111.4±11.8 150.4±9.9 159.7±11.2 182.0±27.6高濃度High dosage（3×105）67.3±6.0 87.0±8.5＊＊ 101.5±12.8＊＊ 105.3±14.4＊＊ 122±23.5＊＊中濃度Mid dosage（1×105）65.6±6.5 88.2±9.4＊＊ 105.9±10.9＊＊ 112.0±13.3＊＊ 137.8±15.4＊＊低濃度Low dosage（0.5×105）68.2±4.7 84.6±7.5＊＊ 100.5±11.2＊＊ 101±12.1＊＊ 126±27.2＊＊

3 討論

表2 各組動物肺癌成模情況Tab.2 The establishment status of lungcancermodels in the rats

2.4 肺部大體解剖情況

正常組大鼠，常規解剖后肉眼觀察，各器官未見異常變化，肺部表面光滑；10只高濃度模型組大鼠，肺部均見有中央型、彌漫性病灶，呈結節狀，不規則，結節表面光滑，與周圍正常組織邊界清楚，質硬，灰白。中、低濃度模型組部分大鼠肺部也可見少數腫塊結節。各模型組大鼠肝臟、脾臟等器官均未發現異常（圖1）。

2.5 肺部病理學檢查

經過HE染色，鏡下可見高濃度模型組10只大鼠（10/10）、中濃度模型組有8只大鼠（8/10）、低濃度模型組有3只大鼠（3/10）的肺部組織可見不規則的癌巢，腫瘤細胞排列緊密，癌細胞核大，漿少、核分裂相多見、核內染色質粗糙，部分呈空泡狀，周圍炎癥細胞浸潤，癌巢形態大小不一（圖2，圖1、2見彩插7）。所有模型組大鼠的肝臟和脾臟未見癌細胞轉移（圖3、圖4，見彩插8）。

肺癌療效得不到提高的主要障礙在于肺癌臨床表現復雜，難以早期發現，復制出與人類肺癌發病機制、發展過程相似的動物模型是腫瘤學研究必不可少的手段之一。目前肺癌動物模型的制備方法多采用誘發性、移植性或轉基因動物模型。移植性動物模型又可分為原位移植和異位移植，其中異位移植因其方法簡便、成模率高而被廣泛應用，但該類模型適用于抗癌藥物療效檢測，不適合用于腫瘤發生和形成機制的研究。原位移植動物模型被認為是目前比較理想的模型，主要通過將癌細胞直接注射到肺部支氣管復制肺癌原位模型［3、4］，該模型能較真實地模擬肺癌患者的臨床特征，但手術操作難度較大，動物死亡率高，成瘤率低。

Walker256腫瘤是大鼠自發性乳腺癌，多移植于SD大鼠或W istar大鼠這兩種遠交系動物中，用于腫瘤學基礎研究或細胞傳代［5］。Walker256也被用于移植性肺癌模型的制作［6］。

本研究選取KM小鼠腹腔注射Walker256癌細胞，成功制備了腹水瘤細胞懸液，采用尾靜脈注射Walker256癌細胞懸液的方法建立大鼠移植性肺癌模型，比較三個不同細胞濃度的肺癌成瘤情況。結果顯示，造模14 d后，模型組動物出現攝食減少，活動減少，皮毛欠光澤等惡病質體征；造模21 d時，注射高濃度Walker256癌細胞（3×105個細胞/只）的動物肺部均出現肉眼可見癌結節，成瘤率為100％，肺臟系數和肝臟系數遠遠高于正常對照組。HE結果顯示，不同濃度組動物肺部均發現多發性癌灶，但并未出現其他臟器轉移，與肺原位接種方法建立的肺癌模型病理結果類似［7］。在生存狀態上，此模型大鼠的癥狀與臨床上癌癥病人消瘦、乏力、食欲不振等臨床病癥類似，為藥物的初步篩選提供參考依據。相比于傳統的移植性肺癌造模方法，此造模方法簡單可行，成模時間短，成模率高，與肺癌的發展進程較一致，但腫瘤轉移率不高，不能反映晚期癌癥病人的臨床生物學體征，仍有待進一步的研究。

本研究采用尾靜脈注射Walker-256細胞成功建立大鼠移植性肺癌模型，可作為腫瘤學可靠的研究手段之一，為腫瘤發病機制及治療研究奠定實驗基礎。

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