兩種人乳腺癌裸鼠移植模型的建立

饒子亮，黃 威，鄭佳琳，孫 俠，黃紅坤，鐘志勇，王 剛

（廣東省醫學實驗動物中心，佛山 528248）

乳腺癌是一種嚴重危害婦女健康的惡性腫瘤，其發病率在世界范圍內呈上升趨勢，居婦女惡性腫瘤的首位或第2位［1］。在對其生物學行為的認識及發展新的治療方法上，乳腺癌動物模型起著舉足輕重的作用［2-4］。在實踐中人們發現，由于乳腺癌細胞株自身的生物學特性所限，很多人乳腺癌細胞株在小鼠模型上成瘤率很低，大大影響了建模的穩定性和可靠性［5］。目前國內報道的乳腺癌模型多數來源于動物或者需要手術，且缺少對人源性乳腺癌模型制作的報道。本研究的目的是建立簡便的人乳腺癌裸鼠移植模型。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與飼養條件

SPF級BALB/c裸鼠20只，雌性，周齡5～6周，由廣東省醫學實驗動物中心提供［SCXK（粵） 2008-0002］。裸鼠飼養在廣東省醫學實驗動物中心SPF級實驗動物室IVC系統內，動物實驗環境設施合格證號：SYXK（粵）2008-0002，室內保持20～25℃，濕度40～70％，自由飲水、進食，水料充足，SPF級飼料產自廣東省醫學實驗動物中心。

1.2 細胞

MDA-MB-231和SK-BR-3乳腺癌細胞來源于中科院上海細胞庫。

1.3 主要試劑和儀器

RPMI 1640培養基，GIBCO公司生產，批號：8110164；胎牛血清：GIBCO公司生產，批號：20091031：青/鏈霉素雙抗，杭州吉諾生物醫藥有限公司生產，批號：10081201；胰酶，杭州吉諾生物醫藥有限公司生產，批號：10210302。

倒置顯微鏡，日本奧林巴斯產品，型號：CKX41；無菌超凈臺，蘇州凈化有限公司，型號：SW-CJ-2FD；恒溫CO2孵箱，美國Thermo，型號：311。

1.4 實驗方法

取對數生長期的MDA-MB-231和SK-BR-3細胞，經胰酶消化后，用Hank液清洗2次，再用1％錐蟲藍染色，在細胞記數板上作細胞記數，并調節使活細胞濃度為5×107/m L，于裸鼠左側腋窩皮下下接種0.2 m L/只，各接種10只。腫瘤細胞接種后，每d觀察腫瘤生長情況，每周測量腫塊的大小。按公式V=1/2×長×寬×寬，計算腫瘤大小，并繪制生長曲線。第30天脫頸處死荷瘤鼠，皮下剝離腫瘤稱重，記錄質地、浸潤、血供情況，觀察有無粘連，各臟器轉移狀況，將腫瘤組織置于10％的福爾馬林固定液中待檢。

1.5 病理學檢測 上述標本常規石蠟包埋切片，HE染色，光鏡觀察。

1.6 數據處理

所有數據均運用SPSS11.0進行t檢驗分析，各組計算數據均采用（±s）表示。

2 結果

2.1 裸鼠體重

裸鼠接種MDA-MB-231和SK-BR-3乳腺癌細胞后，體重均緩慢增長。

2.2 腫瘤生長狀況

MDA-MB-231移植瘤5 d潛伏期后，接種部位皮下可見灰白色結節，后呈圓形或橢圓形生長，自接種第7天腫瘤可測量開始，每周測量腫瘤體積大小，繪制生長曲線見圖2。腫瘤生長較緩慢，接種成功率為90％（9/10）。接種42 d后，腫瘤平均體積達到426.6 mm3，瘤重0.417 g，見表1。

SK-BR-3移植瘤11 d潛伏期后，接種部位皮下可見灰白色結節，后呈圓形或橢圓形生長，自接種第14天腫瘤可測量開始，每周測量腫瘤體積大小，繪制生長曲線見圖2。腫瘤生長緩慢，接種成功率為80％（8/10）。接種42 d后，腫瘤平均體積達到357.5mm3，瘤重0.325 g，見表1。

表1 42 d乳腺癌裸鼠移植瘤體積和重量Tab.1 42 d Tumor volume and Weight in the breast tumor-bearing nudemice

2.3 尸檢結果

圖2 移植瘤生長曲線Fig.2 Growth curve of the transplanted tumors

肉眼觀查，兩種腫瘤呈橢圓形包塊，包膜完整，中等硬度，切面呈灰白色。除個別有局部浸潤外，大多與周圍組織分界清楚，較易剝離，未見腹水生成及組織粘連，各臟器表面光滑，未見結節。

2.4 病理檢查結果

MDA-MB-231細胞株移植瘤組織，鏡下見腫瘤細胞呈不規則的團塊狀及片狀分布，分化程度低，腫瘤細胞異型性明顯，細胞核呈圓形或卵圓形，細胞核大，核異型性明顯，易見核分裂象。9例組織中，4例見壞死面積占切片總面積的5％～25％，記1分；5例見壞死面積占切片總面積的25％～50％，記2分。（彩插1圖5） SK-BR-3細胞株移植瘤組織，鏡下見腫瘤細胞呈不規則的團塊狀及片狀分布，分化程度低，腫瘤細胞異型性明顯，細胞核呈圓形或卵圓形，細胞核大，核異型性明顯，易見核分裂象。8例組織中（A1-4）均見壞死面積占切片總面積的25％～50％，記2分。（彩插1圖6）

3 討論

小鼠模型一直是乳腺癌醫學研究的一個重要基礎，乳腺癌細胞的成瘤是建模的一個關鍵部分。然而，受某些生物學特性的影響，很多乳腺癌細胞株在小鼠模型上的成瘤率往往較低。一些研究在體外實驗向體內實驗的過渡中，往往因此而增加工作量，甚至受到阻礙［6，7］。有學者推測，小鼠體內的雌激素水平遠低于人類是導致這一現象的主要原因，由此需通過各種方法向實驗鼠體內輸入雌激素。但多數給藥方法如灌胃或注射，操作重復繁瑣，且不符合生理，劑量難以掌握，以至于收效甚微。更重要的是，極為頻繁的給藥操作對小鼠造成了很大的傷害和擾動，將干擾實驗結果。最為成功的皮下埋植緩釋劑因價格過于昂貴和起效時間達不到實驗要求而應用受到限制。值得注意的是，雌激素水平只是眾多干擾因素的一種，不能解釋所有細胞株的問題。

本研究結果顯示：腫瘤細胞移植后，荷瘤裸小鼠在SPF級環境IVC系統中存活、生長良好，易于飼養。皮下移植方法簡單，易于操作，成功率較高，MDA-MB-231達到90％（9/10），SK-BR-3達到80％（8/10）。腫瘤生長情況易于觀察。腫塊切除后行病理學切片檢查擬診為浸潤性導管癌，說明移植的腫瘤細胞保持了人乳腺癌腫瘤細胞的部分病理學特點及生物學特性，為臨床治療及療效判斷提供了可靠的工具。實驗過程中觀察到，腫瘤細胞移植后1周左右，即有腫瘤存活生長征象，并逐漸長大，腫瘤生長緩慢。由于腫瘤生長在皮下，非常容易觀察實驗藥物的療效及腫瘤大小的變化，可用于乳腺癌生長觀察及藥物的療效研究。

為了提高腫瘤的接種成功率應注意以下幾個方面：①裸鼠周齡控制在5-6周，最好飼養于SPF級環境IVC系統內。②細胞狀態要好，生長旺盛，無污染；接種時要取對數生長期細胞，活細胞數要＞95％。③要確保細胞數量，本實驗使用的是1× 108/m L，可多次計數然后取均值確保計數準確。④皮下接種時，以近頭側成功率高，且以腋窩為佳［8］。⑤注射器抽吸瘤細胞懸液時要混勻，注射時要使細胞積聚成團在皮下形成皮丘，抽針后要夾針孔防外溢。⑥進行批量接種時應在1 h內注射完畢，時間過長腫瘤細胞易死亡，導致接種失敗［9］。

［1］李樹玲.乳腺腫瘤學［M］.北京：科學技術出版社，2000：3 -7.

［2］余微波，谷俊朝.乳腺癌動物模型的建立［J］.國外醫學外科學分冊，2005，32（1）：63-66.

［3］Hutchinson JN，Muller WJ.Transgenic mouse models of human breast cancer［J］.Oncogene，2000，19：6130-6137.

［4］白紹槐，趙揚冰，張旋波，等.人乳腺浸潤性導管癌裸鼠移植模型的建立［J］.華西醫科大學學報，1999，30（2）：220 -221.

［5］夏添松，王玨，肇毅，等.人源性乳腺移植模型：有效提高人源性乳腺癌細胞株在小鼠原位成瘤率的途徑［J］.外科理論與實踐，2010，15（1）：47-50.

［6］Kerbel RS.Human tumor xenografts as predictive preclinical models for anticancer drug activity in humans：bet-ter than commonly perceived-but they can be improved［J］.Cancer Biol Ther，2003，2（4 Supp l 1）：S134-S139.

［7］Sausville EA，Burger AM.Contributions of human tumor xenografts to anticancer drug development［J］.Cancer Res，2006，66（7）：3351-3354.

［8］龔張斌，陳濤.胃癌動物模型制作概況［J］.腫瘤學雜志，2002，8（5）：35-37.

［9］田慶鍔，李瑪琳.人腫瘤細胞懸液裸鼠皮下接種及影響移植成功的因素.實驗動物科學與管理，2004，21（3）：47-50.