心臟特異表達腎素（原）受體轉基因小鼠的建立

廉 虹，馬元武，劉 寧，全雄志，張連峰

（中國醫學科學院，北京協和醫學院，醫學實驗動物研究所，衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，國家中醫藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021）

腎素-血管緊張素系統 （renin-angiotensin system，RAS）是控制血壓和和體內電解質平衡經典的調節系統。2002年，Nguyen等［1］利用重組的帶有放射性標記的人源腎素，在人類腎臟cDNA庫中篩選出了一個與以往發現的任何膜受體蛋白均無同源性的受體蛋白，即腎素（原）受體［（p）RR］。（p） RR是一種小分子量蛋白，含有350個氨基酸，分子量35～39×103，由大段的細胞外（EC）部分，單次跨膜區（TM）和一個短的細胞內（IC）部分組成。由于腎素（原）受體最初發現是與V-ATPase（囊泡H+-ATPase）偶聯，所以編碼此蛋白的基因被命名為ATP6ap2（ATPase 6 accessory protein2）［2，3］。

（p）RR在人體內廣泛表達：其中在心臟、腦、胎盤中表達最多，在肝、腎臟和胰腺中表達次之，在肺和骨骼肌組織也有少量表達。序列比對分析顯示，（p）RR在各物種間的同源性非常高，人的（p）RR與大鼠、小鼠、雞、青蛙和斑馬魚等均具有較高同源性［4］，推測這個基因在生命體中具有重要的功能。在人類此基因存在于X染色體上。至今，已經發現了兩種與（p）RR相關的疾病，一種是該基因的4號外顯子的剪切增強子發生321位C〉T的沉默突變引起神經系統智力缺陷、癲癇和共濟失調等病癥［5］；第二種是（p）RR基因多態性的（IVS）5+169C〉T （rs5918007）基因型與人類高血壓相關［6，7］。

（p）RR敲除會導致胚胎致死，這很大程度的限制了研究者的研究進程。隨后，Celine A等［8］構建了血管平滑肌細胞（VSMC）特異表達（p）RR的轉基因大鼠，發現6月齡的大鼠出現血壓升高、心率加快的現象，并且癥狀隨年齡的增加更加嚴重。在糖尿病大鼠的心臟中，（p）RR在蛋白和mRNA水平均增加三倍［9］。這些結果說明（p）RR可能參與高血壓與糖尿病等病理過程。由于該基因在心肌中有廣泛表達，我們推測它在心臟的生理功能中發揮一定的作用。因此，本文構建了心臟特異表達（p）RR的轉基因小鼠，并初步探討了該基因對心臟功能的影響。

1 材料和方法

1.1 （p）RR基因的克隆和轉基因小鼠的制備

從OriGene公司購買的帶有（p）RR cDNA的質粒（Sc111138），通過PCR擴增獲得帶有SalI和AflII酶切位點的（p）RR基因cDNA目的片斷，引物序列如下Ps（SalI）：5＇-CCGGTCGACCACCATGGC TGTGTTTG-3＇；Pa（A flII）：5＇-CTCTACTTAAGCAT CACAGGCACACACAA-3＇（由invitrogen公司合成）。反應條件：94℃預變性5min，變性94℃30s，退火62℃30s，延伸72℃2m in，共30個循環。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳純化后克隆到pMD18-T Vector，經測序比對后，正確無突變堿基序列連入α-MHC（Genbank accession no.U_71441，clone 26）啟動子下游，構建心臟特異表達（p）RR的轉基因載體，經NotⅠ將表達載體線性化，Sephedex G50柱純化，將DNA濃度調整至5 ng/μL，用顯微注射法注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中（C57BL/6J康藍公司SCXK（京）2004001），用ICR小鼠作假孕受體，制備轉基因小鼠（TE2000-U顯微注射儀）。實驗中涉及動物的操作程序已經得到醫科院實驗動物研究所動物福利和管理委員會的批準，批準號：ILASGC-2010-033。

1.2 PCR法鑒定（p）RR轉基因小鼠的基因型

轉基因小鼠在出生9～14 d用剪趾法標記，收集剪下的組織，用堿裂解法提取基因組DNA［10］，用PCR法對轉基因小鼠進行基因型檢測。αMHC-（p） RR轉基因小鼠PCR引物序列如下Ps：5＇ CTTTCAGTCACATTGCGGCA-3＇，Pa：5＇-TGCGTTCCC ACCATAGAGAC-3＇（由invitrogen公司合成），反應條件為：94℃預變性5 m in，變性94℃30 s，退火59℃30 s，延伸72℃30 s，共30個循環。

1.3 Westernblot

用小鼠脫頸椎法，犧牲小鼠，取100 mg心臟組織加入1 m L預冷的蛋白裂解液，冰上充分研磨，之后冰上靜置30 min，再將組織勻漿于4℃，12000 r/ m in離心30 m in，吸取上清即為心臟組織總蛋白。取30μg蛋白上樣，15％的SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白轉移到0.45μm硝酸纖維素NC膜上（Millipore，美國）。5％脫脂奶粉封閉液，室溫下置搖床上封閉1 h，再用TBST稀釋的羊抗人源重組的（p）RR多克隆抗體（AF5176，R＆D，美國）（1∶250稀釋），4℃搖床雜交過夜。次日，待恢復室溫后，TBST洗3次，每次10 min。置入TBST稀釋的辣根過氧化物酶標記的兔抗羊抗體（Pierce，美國）（1∶15000），室溫雜交1 h，采用HRP-GAPDH作為內參，TBST洗3次，每次10 min。將膜置于化學發光液中，X-Ray膠片曝光、顯影及定影。

1.4 免疫組織化學

選用3月齡的轉基因陽性和同窩陰性小鼠心臟固定在中性福爾馬林中24 h，進行脫水、包埋、切片，常規脫蠟入水，枸櫞酸鈉抗原熱修復，待恢復室溫后3％H2O2去內源性過氧化物酶，山羊血清封閉，滴加（p）RR抗體（AF5176，R＆D，美國）（1∶50稀釋），濕盒內4℃過夜；PBS洗3×5 min后加入兔抗山羊二抗（具體用法詳見二步法免疫組化試劑盒，PV-2003），PBS洗3×5 m in，DAB顯色，自來水沖洗，蘇木素復染，脫水、透明、封片，光鏡下常規觀察病理切片。

熱修復和去除過氧化物酶的病理切片，分別滴加識別高爾基體標志蛋白抗體：GM30（ab1299，Abcam，美國）（1∶100）/識別肌漿網標志蛋白抗體：PDI（ab2792，Abcam，美國）（1∶100）和（p）RR抗體（ab64957，Abcam，美國）（1∶25稀釋）濕盒內4℃過夜，PBS洗3×5 min后加入DyLight-標記的抗小鼠IgG（1∶100，KPL）and A lexa 488-標記的羊抗兔IgG （1∶100，Invitrogen）37℃孵30 min，ProLong Gold抗淬滅劑封片（Invitrogen）。制備好的病理切片利用共聚焦顯微鏡觀察分析（Leica TCS SP2，Germany）.

1.6 心臟超聲檢查

選用3月齡的轉基因陽性和同窩陰性小鼠，用三溴乙醇（0.2 m L/10g體重）麻醉，脫去心前區的被毛，選用30 Hz的探頭，按Zhou［11］報道的方法進行心臟超聲影像分析（Vevo770小動物超聲探測系統，加拿大）。記錄左室收縮末期內徑（left ventricular internal diameter at end-systole，LVID；s）等參數，左室收縮末期容積（left ventricular end-systolic volume，LVESV），射血分數（percent ejection fraction，EF％），短軸縮短率（percent fractional shortening，FS％）由計算得出。

1.7 統計學分析

數據SPSS統計軟件處理。先進行數據的方差齊性檢驗，組間比較采用獨立性t檢驗。計量數據用均數±標準差（±s）表示。

2 結果

2.1 （p）RR轉基因小鼠的建立

用PCR法從購買的質粒中擴增出人源（p）RR基因，測序結果顯示同已報道的（p）RR序列完全一致（GenBank No.NM_005765.2），將其連到α-MHC心臟特異表達的啟動子下游，構建α-MHC-（p）RR轉基因表達載體（彩插3圖1A）。小鼠出生14 d提取基因組DNA，用PCR擴增（p）RR基因339 bp目的片段，鑒定（p）RR轉基因小鼠的基因型（彩插3圖1B），共得到4只首建鼠，且均可傳代。分別提取（p）RR首建鼠的F1代陽性轉基因小鼠和同齡陰性對照小鼠心臟組織總蛋白，用（p）RR抗體進行Western blot分析，篩選出一個高表達明顯的品系，Western blot圖譜顯示有三條目的帶，分子量大小分別約為：35×103，30×103和28×103。35×103的蛋白帶是全長的（p）RR，30×103和28×103兩條蛋白帶為其截短形式［s（p）RR］，從圖中我們可以看出，轉基因小鼠心臟組織內全長的（p）RR蛋白表達量沒有明顯增加，而兩種截短的蛋白表達量卻明顯的高于同窩陰性小鼠（彩插3圖1C）。取1月齡轉基因小鼠和同窩陰性對照小鼠用（p）RR抗體進行心臟免疫組化分析，結果顯示轉基因小鼠的心臟中（p）RR的表達明顯高于同窩陰性對照小鼠（彩插3圖1D）。

2.2 免疫熒光共聚焦方法進行（p）RR亞細胞結構的定位

取3月齡轉基因小鼠和同窩陰性對照小鼠，取出心臟制備成石蠟切片，分別用識別高爾基體或內質網的標志分子的抗體與（p）RR抗體進行雙色熒光免疫組化分析，結果顯示轉基因小鼠和對照小鼠的（p）RR蛋白與兩種細胞器的標志分子能達到共定位，說明轉基因表達的（p）RR蛋白與內源（p）RR蛋白均存在于高爾基體和內質網上，并且可以看出轉基因小鼠心臟中（p）RR蛋白的表達要明顯高于同窩陰性對照小鼠心臟中的表達（彩插4圖2A，B）。

2.3 超聲檢查（p）RR轉基因小鼠的心臟幾何構型及心功能

將3月齡的 （p）RR轉基因小鼠和同窩陰性對照小鼠進行心臟超聲影像分析（表1），結果顯示，與同窩陰性對照小鼠相比，（p）RR轉基因小鼠收縮期左室內徑（LVID，systolic）降低9％（P＜0.05，n= 18），收縮期容積（LVESV，systolic）減少了23％（P＜0.05，n=18），射血分數EF（ejection fraction）升高14％（P＜0.01，n=18），短軸縮短率FS（fraction shortening）升高20％（P＜0.01，n=18）。結果說明，（p）RR基因的轉入增強了心臟的收縮性能，使心功能有了明顯的提高。

2.4 轉基因表達（p）RR基因使轉基因小鼠心臟中鈣泵、鈉-鈣交換體1表達下調，肌鈣蛋白T表達上調

提取3月齡的（p）RR轉基因小鼠和同窩陰性對照小鼠心臟組織總蛋白，進行鈣泵（ATP2A2）、鈉-鈣交換體1（NCX 1）以及肌鈣蛋白T（cTnT）抗體的Western blot檢測分析，結果發現ATP2A2和NCX 1表達均下調，其中鈣泵表達量的降低十分顯著；而肌鈣蛋白T表達量上調（圖3）。

3 討論

自2002年Nguyen等［1］首次報道了人腎素（原）受體的存在之后，人們關于此受體的生物功能研究都集中在全長的（p）RR形式。Cousin等［12］通過對小鼠胚胎干細胞（E14），大鼠平滑肌細胞（VSMC）和中國倉鼠卵巢細胞（CHO）等多種細胞的培養基進行Western blot分析，發現一個28×103（p）RR低分子量形式的存在，由于這種形式的蛋白是在培養基中發現的，所以被命名為s（p）RR。進一步研究發現，s（p）RR是由弗林蛋白酶剪切產生的，而且s（p）RR存在于血漿和尿液中。不久，Yoshikawa等［13］發現了一種由ADAM19剪切產生的游離在培養基中一種s（p）RR形式，這兩種s（p）RR形式是否是（p）RR的同一種剪切形式以及它們各自的功能，現在還有待進一步研究。本文構建的（p）RR轉基因小鼠，除了全長的（p）RR外，兩條截短的蛋白從分子量大小上看，應該就是以上兩篇文獻中的所發現的s（p）RR，本文構建的轉基因小鼠全長（p）RR蛋白沒有明顯增多而兩種s（p）RR蛋白明顯高于同窩陰性對照小鼠，這一點還有待進一步解釋。這兩個獨立的研究小組［12，13］在體外培養的細胞中也都進行了（p）RR的亞細胞定位，結果表明（p）RR主要存在于內質網、高爾基體、溶酶體等細胞器中。本研究在小鼠心臟組織中進行了（p） RR蛋白的定位研究，證實了過表達的（p）RR蛋白與內源性的（p）RR蛋白在小鼠心臟組織中均定位在內質網和高爾基體上，并且轉基因小鼠心臟中（p）RR蛋白的表達明顯高于對照小鼠心臟組織。心肌細胞中內質網結構非常發達，對鈣的儲存、釋放和心臟的收縮、舒張起到重要的作用，（p）RR定位在內質網上可能更有利于其參與到心肌節律性收縮舒張活動過程中。高爾基體是將蛋白進行加工、分類和包裝的主要場所，推測（p）RR的兩種s （p）RR形式在高爾基體上被剪切產生，并且駐留于此。

表1 三月齡（p）RR轉基因小鼠心臟結構和功能M超生分析（n=18） Tab.1 The cardiac structure and function analysis of 3-month transgenic mice by M-mode echocardiograph（n=18）

圖3 轉基因表達（p）RR引起ATP2A2、NCX 1和cTnT蛋白表達變化Fig.3 Transgenic（p）RR leading to alter the expression level of ATP2A2/NCX 1/cTnT

鈣離子作為興奮-收縮的偶聯介質，在維持心肌正常收縮和舒張過程中起到重要的作用。心肌細胞的收縮和舒張與細胞內鈣的釋放與儲存相偶聯。鈣循環主要包括內質網中儲存的鈣的釋放、鈣的回攝和鈣的儲存三個過程。位于細胞膜表面的L型鈣通道受到刺激后會激活內質網膜上的RyR受體（ryanodine receptor）從而引起內網中鈣的釋放，此時游離的鈣離子會結合肌鈣蛋白引起肌絲的滑動，使心肌產生收縮運動，隨著舒張過程的開始內質網膜上的ATP2A2逐步將細胞內游離的鈣回收至內質網中，同時NCX 1也將少部分的鈣轉運至細胞膜外。可以看出在這一過程中ATP2A2和NCX 1主要起到將細胞中游離的鈣轉運回內質網中，并且在這一過程中ATP2A2起到關鍵的作用。本文中發現（p）RR轉基因小鼠心臟中ATP2A2和NCX 1表達量明顯降低，這顯然影響了游離鈣離子向內質網中的回攝，細胞內鈣離子濃度持續的維持在高濃度的狀態下，類似于鈣超載的狀態，使肌鈣蛋白等鈣相關蛋白不得不繼續工作，造成心肌收縮力增強。同時我們檢測的肌鈣蛋白T在（p）RR轉基因小鼠心臟中的表達確實也是升高的。心臟超聲結果同時顯示，（p） RR轉基因小鼠心臟心功能明顯增強，這也是心肌收縮力增強的結果。

在心臟中過表達（p）RR能夠引起心臟收縮功能明顯增強，同時我們發現ATP2A2、NCX 1和cTnT蛋白表達量出現了明顯變化，轉基因小鼠心功能增強。過表達的（p）RR是如何調節這些鈣離子相關蛋白的從而影響到了心臟功能，這些都有待于我們進一步研究。不過本研究提示我們，（p）RR可能是通過調節心臟中的鈣離子從而影響心肌功能的。在接下來的的研究中，我們將從分子機制出發，探求該轉基因小鼠的表型的內在機制，更加深入的研究（p）RR在心臟中的生物學活性。

（p）RR的發現，為經典的腎素-血管緊張素系統增添了新的內容，使這一系統重新成為研究熱點。目前人們已經發現（p）RR在心血管方面的重要性，關于（p）RR在心臟中發揮的生物活性還有待進一步研究，它可能成為治療心血管疾病的重要靶點并且對其信號通路的研究有利于我們對一些心血管疾病發生發展的分子機制的深入了解。

［1］Nguyen G，Delarue F，Burckle C，et al.Pivotal role of the renin/ prorenin receptor in angiotensin II production and cellular responses to renin［J］.J Clin Invest，2002，109（11）：1417 -1427.

［2］Burckle C and Bader M.Prorenin and its ancient receptor［J］.Hypertension，2006，48（4）：549-551.

［3］L＇Huillier N，Sharp，M.G.F.，Dunbar，D.R.and Mullins，J.On the relationship between the renin receptor and the vacuolar proton ATPase membrane sector associated protein（M8-M9）［J］.Basic Science for the Cardiologist，2006，20：17-34.

［4］Wakeel A，Kuriakose JA and McBride JW.An Ehrlichia chaffeensis tandem repeat protein interacts with multiple host targets involved in cell signaling，transcriptional regulation，and vesicle trafficking［J］.Infect Immun，2009，77（5）：1734-1745.

［5］Ramser J，Abidi FE，Burckle CA，et al.A unique exonic splice enhancer mutation in a family with X-linked mental retardation and epilepsy points to a novel role of the renin receptor［J］.Hum Mol Genet，2005，14（8）：1019-1027.

［6］Hirose T，Hashimoto M，Totsune K，et al.Association of（pro） renin receptor gene polymorphism with blood pressure in Japanese men：the Ohasama study［J］.Am JHypertens，2009，22（3）：294 -299.

［7］Ott C，Schneider MP，Delles C，et al.Association of（pro）renin receptor gene polymorphism with blood pressure in Caucasian men［J］.Pharmacogenet Genomics，2011，21（6）：347-349.

［8］Burckle CA，Jan Danser AH，Muller DN，et al.Elevated blood pressure and heart rate in human renin receptor transgenic rats［J］.Hypertension，2006，47（3）：552-556.

［9］Connelly KA，Advani A，Kim S，et al.The cardiac（pro）renin receptor is primarily expressed in myocyte transverse tubules and is increased in experimental diabetic cardiomyopathy［J］.J Hypertens，2011，29（6）：1175-1184.

［10］Truett GE，Heeger P，Mynatt RL，et al.Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris （HotSHOT）［J］.Biotechniques，2000，29（1）：52，54.

［11］Zhou YQ，Foster FS，Nieman BJ，et al.Comprehensive transthoracic cardiac imaging in mice using ultrasound biomicroscopy with anatomical confirmation by magnetic resonance imaging［J］.Physiol Genom ics，2004，18（2）：232 -244.

［12］Cousin C，Bracquart D，Contrepas A，et al.Soluble form of the （pro）renin receptor generated by intracellular cleavage by furin is secreted in plasma［J］.Hypertension，2009，53（6）：1077 -1082.

［13］Ayumu Yoshikawa YA，Ken-ichi Kusano，Fukuko Kishi，Teruo Susumu，Shinichiro Iida，Shoichi Ishiura，Shigeyuki Nishimura，Masayoshi Shichiri and Takaaki Senbonmatsu.The（pro）renin receptor is cleaved by ADAM19 in the Golgi leading to its secretion into extracellular space［J］.Hypertension Research 2011，34：599-605.