四川省自貢市兒童與成人分離肺炎鏈球菌株的血清型分布及抗生素敏感性比較

章 成，董一山，黃文祥

(1.四川省自貢市第四人民醫院感染科，四川 自貢 643000;2.重慶市江津區中心醫院呼吸內科，重慶 402260; 3.重慶醫科大學附屬第一醫院，重慶醫科大學寄生蟲感染研究所，重慶 400016)

肺炎鏈球菌是社區獲得性肺炎、院內獲得性肺炎比較常見細菌之一［1，2］，且感染率有逐年上升的趨勢，可導致嚴重的多器官功能損害，是導致老年人群、兒童人群死亡的常見致病菌之一。根據莢膜多糖不同的抗原性，可將肺炎鏈球菌分為90個血清型［3］，其常見的血清分型流行情況存在著一定的地理差異，對不同地區肺炎鏈球菌進行正確的血清型分型以明確該地區的常見血清型，對該地區預防接種選用合適的肺炎多糖疫苗，以及指導臨床抗生素運用，減少肺炎死亡率具有重要意義。本研究通過對2009年6月至2010年6月四川省自貢市兒童與成人分離出的肺炎鏈球菌株常見血清型和藥敏情況分析比較，了解不同人群分離肺炎菌的血清型特點及藥物敏感特點，用于指導本地區疫苗及抗菌素合理運用。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 2009年6月至2010年6月收集四川省自貢市四家醫院門診、住院部分離的166株肺炎鏈球菌。86株來源于兒童(來源:自貢市第一人民醫院22株，自貢市婦幼保健院35株，自貢市第四人民醫院21株，自貢市第三人民醫院8株)，80株來源于成人(來源:自貢市第一人民醫院30株，自貢市第四人民醫院32株，自貢市第三人民醫院18株);64株來源于痰培養，80株來源口咽試紙，10株來源血培養，10株來源分泌物，2株來源腦脊液培養。藥敏質量控制株肺炎鏈球菌ATCC49619由重慶市寄生蟲病傳染病學重點實驗室保存。血清分型質量控制株1型肺炎鏈球菌購自丹麥國家血清研究所。

1.2 細菌鑒定 依據菌落特點、奧普拓欣敏感試驗、膽酸溶菌試驗及肺炎鏈球菌分型抗血清鑒定［5，6］。所用Columbia基礎培養基購自重慶龐通醫療器械有限公司，Mueller-Hinton(MH)液體培養基購自Oxoid公司，5%脫纖維綿羊血購自重慶醫科大學動物中心。

1.3 血清學分型 用pneumo test-kit試劑盒(購自丹麥Statens Serum institute)，采用丹麥Neufeld在1902年建立的莢膜腫脹實驗進行血清學分型。嚴格按照使用說明，使特異性抗血清與肺炎鏈球菌的莢膜抗原特異性結合形成復合物，則細菌莢膜顯著增大、腫脹，相差顯微鏡下則發現莢膜顯著腫大，菌體周圍出現一無色而寬的環狀物，判斷莢膜腫脹試驗陽性。該試劑盒對多數菌株僅能作群的鑒別。

1.4 藥敏試驗 采用瓊脂稀釋法測定166株肺炎鏈球菌對頭孢唑林、青霉素、阿奇霉素、克林霉素和左氧氟沙星等五種抗生素的最低抑菌濃度(MIC)。判斷界值參照 CLSI標準(2009年版)應為［7］。ATCC 49619作為質控株跟隨整個試驗過程，結果完全在控。所用標準品:頭孢唑林粉劑(200 mg)、青霉素粉劑(200 mg)、阿奇霉素粉劑(200 mg)、克林霉素粉劑(200 mg)、左氧氟沙星粉劑(200 mg)均購自中國藥品生物制品檢定所。方法:采用二倍瓊脂稀釋法檢測所有菌株的MIC，即先將各種抗菌藥標準品倍比稀釋成多種梯度濃度，將各濃度的藥液分別加入到已溶化并冷卻至50℃左右的含5%脫纖維綿羊血MH瓊脂中，混勻后立即傾注平皿，使培養基的抗生素最終濃度達到檢測的標準藥物濃度。用微量多點接種儀將標準濃度的菌懸液接種到含不同濃度抗菌藥物的上述瓊脂平板表面，置36℃的二氧化碳孵箱中培養24小時觀察結果，以抑制細菌生長的最低抗生素濃度確定為MIC，分別統計MIC范圍MIC50、MIC90、MIC眾數值，并根據抗菌藥物敏感的臨界濃度，計算對細菌的敏感率、耐藥率。

表1 166株肺炎球菌菌株的血清學分型分布情況［株(%)］

1.5 統計學方法 藥物敏感性分析采用世界衛生組織細菌耐藥性監測中心推薦的WHONET 5.3軟件，有關率的比較采用SPSS 11.5軟件處理，用χ2檢驗或Fisher精確概率法進行統計學分析，P＜0.05提示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血清學分型 166株菌共分離出22種血清群或型，其中兒童常見血清型為19、23、14、6和15群，共63株，占兒童分離菌株73.3%;成人常見血清型為19、23、18、5和33群，共56株，占成人分離菌株的70%。兩人群除19群、23群外，其余血清型存在較大的差異(P＜0.05)，見表1。

2.2 兒童與成人分離菌株的體外藥敏比較 成人分離菌株對青霉素的敏感率為52.5%顯著高于兒童分離菌株對青霉素的敏感率31.4%，差異有統計學意義(χ2=7.60，P＜0.05);兩人群對阿奇霉素、克林霉素敏感率均較低，對頭孢唑林和左氧氟沙星敏感率均較高，差異均無統計學意義(P＞0.05)，見表2。

表2 兒童與成人分離的常見血清型菌株的體外藥敏比較 (%)

3 討論

3.1 血清型分布 本研究結果與肖素坤［7］、Dunais［8］及趙瑞珍等［9］報道的研究結果存在一定的差異，而與Rivera-Olivero及任紅宇等報道的研究結果極其一致［10，11］，兒童菌株中未發現未分型菌株。血清學分型結果較接近成都地區結果，可能原因為成都地區與本地區地域上接近，流行病學特點較一致［11］。兒童與成人兩人群分離肺炎球菌常見血清型與其他地區不一的原因可能與該地區地理條件、氣候環境、經濟情況、就醫情況、抗生素使用情況、肺炎球菌疫苗使用情況、飲食習慣、人種差異、人群結構差異、風俗習慣等因素有一定關系，以上因素可能導致該地區人群對不同血清型肺炎菌的定植造成影響，當然不同研究采集的樣本量差異也是原因之一，但同一地區不同人群的研究國內較少報道。本研究結果顯示，自貢地區成人和兒童分離菌株的多種血清型(19、23、5、6、10、20、3、9、21、39、17、7、8、12、2、其他可分型以及未能分型)無統計學意義)，而血清型18、14、15、33的分布在兒童和成人之間則存在的差異有統計學意義。具體原因，考慮與不同人群不同呼吸道黏膜不同的生理特點，有利于某些血清型菌株定植;不同人群的肺炎球菌疫苗的不同普及率也是導致血清型不同的原因之一;不同人群生活特點、飲食特點，也可能是影響不同血清型菌株定植的原因，比如吸煙、飲酒對鼻咽環境破壞，有利于某血清型菌株定植;不同人群不同基礎疾病、不同免疫能力，也可能導致不同毒力血清型菌株的選擇定植，有待流行病學進一步研究予以證實。

本研究所用試劑盒僅能對細菌作群的鑒別，不能對具體血清型的鑒定，因此，對各種血清型疫苗對本地區人群免疫保護僅能作粗略的估計，23價、7價肺炎疫苗對兒童人群最大的保護覆蓋率為97.7%(82/86)、67.4%(58/86)，而對成人最大的保護覆蓋率為90%(72/80)、58.8%(47/80)，因而23價疫苗對本地區人群的保護作用明顯高于7價疫苗，尤其對兒童，是本地區較為合適的疫苗。隨著疫苗的應用，肺炎球菌常見血清型可能出現變異。

3.2 抗生素敏感性 本研究結果顯示，從兒童分離出的肺炎球菌青霉素的敏感率僅是31.4%，而成人為52.5%，明顯低于肖素坤等［7］報道的70.2%(兒童)和 84%(成人)，也低于王秋霞報道的68.1%［12］。與Le等報道的較接近［13］，但低于宋秀杰等報道的71.7%［14］，但明顯高于趙瑞珍等報道青霉素敏感率 15.6%［9］及楊曉華等報道的22%［15］;導致不同地區臨床分離肺炎菌藥敏差異原因最主要可能為不同地區臨床抗菌素藥運用有很大關系;本研究結果與國內較多研究表明兒童分離菌青霉素敏感率低明顯低于成人［16］，具體原因考慮由于兒童特定的生理特點，導致臨床醫生在臨床選用抗生素類型以較多選用β-內酰胺類藥物為主，導致肺炎鏈球菌對青霉素藥物選擇壓力增大，導致藥物敏感性下降［17］;本研究結果表明。本地區對青霉素敏感菌株與國內其它地區接近，但高耐藥菌株比例小，青霉素仍可作為本地區臨床成人肺炎球菌感染的治療用藥。

兩人群分離菌株對頭孢唑林的敏感率都高，耐藥率低，兒童分離菌敏感率100%，明顯高于羅勤等報道的48.1%［18］，可能與該藥該于本地區運用普及率低可能有關，可作為本市人群肺炎治療首先藥物。

兒童和成人人群分離菌對左氧氟沙星的敏感率分別是100%、90%，與國內報道［9，11，12，14］較接近，但本研究結果提示兒童敏感率較成人明顯高，可能原因為喹諾酮類藥物對骨骼系統發育影響使得該類藥物在臨床兒童用藥中運用極少，抗生素選擇壓力低，因此敏感性高。該結果進一步證實兒童人群分離菌株與成人分離菌株生物特性存在差異的特點。雖然國內較多報道肺炎菌株對喹諾酮敏感率高，但近年來隨著肺炎鏈球菌對青霉素和大環內酯類藥物的耐藥率上升，其對氟喹諾酮類藥物的耐藥也出現上升趨勢，加拿大學者發現肺炎鏈球菌對環丙沙星耐藥率從1997年的1%上升到2005年的4.2%［19］，需予以警惕，予以監控。

兩組人群分離菌對阿奇霉素和克林霉素的敏感率均極低，低于王秋霞［12］及楊曉華等報道［15］，但與國內較多報道一致［9，11，20～23，24］，考慮肺炎鏈球菌耐藥表型可能為鏈陽霉素B類(MLSв)，即對大環內酯、林可霉素類、鏈陽菌素B聯合耐藥，不能作為本地區該菌感染的治療藥物。

本研究顯示，無論成人還是兒童，分離的常見肺炎鏈球菌血清型對頭孢唑林、青霉素、阿奇霉素、克林霉素和左氧氟沙星等五種抗生素敏感率均明顯低于其他不常見血清型菌的敏感率，其中兒童分離菌青霉素敏感率31.4%，而常見血清型菌株敏感率23.8%;成人分離菌青霉素敏感率是52.5%，而常見血清型敏感率39.3%。另外，對于阿奇霉素、克林霉素，成人及兒童常見血清型肺炎菌的藥敏率均為0，而其他血清型發現敏感菌株，此結果進一步證實細菌對抗菌素藥物選擇壓力導致敏感率下降［17］，而任何地區的常見血清型隨人群結構變異、肺炎球菌疫苗運用、環境變化發生變化，提醒臨床醫生需警惕一個地區的常見血清型的變異情況以及其藥敏變化情況，僅此才能對特定時間段、特定地區的細菌感染疾病進行有效的臨床治療，而不能一成不變的治療一個地區的臨床細菌感染。當然，細菌藥敏性是否與血清型差異有關，比如與某一血清型天然敏感或耐藥，目前尚無相關報道，有待進一步深入研究，了解不同血清型肺炎對各類抗菌素的敏感性特點。

綜上，本市兒童與成人常見血清型有一定的差異，23價肺炎疫苗較7價疫苗對本市兩人群的免疫保護高，是本市理想的肺炎疫苗類型，本結果對于新疫苗的研制提供參考。本市成人分離菌對青霉素、左氧氟沙星敏感率高，青霉素仍可作為成人肺炎臨床治療用藥，但兒童分離菌對青霉素藥敏中介比例高，需予以臨床監測，且兒童肺炎最好予以藥敏試驗后指導用藥，左氧氟沙星可作為本地區成人肺炎治療的理想用藥;本市兩人群分離菌對頭孢唑林敏感率較高，對阿奇霉素及克林霉素的敏感率特別低，此結果可供該地區臨床經驗用藥參考。

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