胸腺肽α1對80歲以上老年人外周血樹突狀細胞體外培養及功能的影響

張興虎 錢曉明 齊玉琴 萬文輝 趙東寶

樹突狀細胞(DC)是已知體內功能最強的一類抗原提呈細胞(APC)，其最大的特點就是能有效刺激原始T細胞，誘導初次免疫應答，也能促進B細胞生成抗體及自然殺傷(NK)細胞的激活，處于機體內免疫應答的中心環節［1-3］。應用粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和白細胞介素4(IL-4)體外可以誘導人外周血單核細胞生成DC(MoDC)，并具有極強的刺激T細胞增殖的能力［4-5］。而胸腺肽α1是一種具有多種效應的免疫增強劑，其除了可以增強NK細胞的能力外，還可以明顯促進同種T細胞的增殖［6］。本研究主要是觀察≥80歲老年人在應用胸腺肽α1后，外周血單核細胞培養所得到的DC生長、活力、存活時間及刺激T細胞增殖情況的改變。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及設備DC培養基CellGro-DC購自德國CellGenix公司;rhGM-CSF、rhIL-4購自上海飛捷公司;絲裂霉素C購自日本Kyowa Hakko kogyo公司;淋巴細胞分離液購自天津TBD公司;DMSO購自美國Sigma公司;倒置顯微鏡(Zeiss Axiovert 40)、MTT(噻唑藍)購自上海生工公司。

1.2 試驗對象選取老年人30例，年齡80～96歲，平均(85.6±4.5)歲，其中男22例，女8例。排除腫瘤、糖尿病、慢性感染、自身免疫性疾病、服用免疫抑制劑，并未接受過免疫增強劑的治療。

1.3 治療方法給予胸腺肽α1注射劑1.6 mg皮下注射，每周2次，療程為1月。

1.4 DC體外培養在治療前后分別將新鮮的抗凝外周血各20 ml，經淋巴細胞分離液梯度離心(20℃，400 g，20 min)，取界面細胞，放入50 ml離心管中，用PBS懸浮細胞，離心(200 g，10 min)洗細胞3次，用Cell-Gro-DC培養基懸浮細胞，加入24孔板，每孔2.5×106細胞/ml培養基，置37℃、5%二氧化碳孵箱(Thermo-Forma)培養2 h后，吸棄上清，用預熱的培養基輕輕洗培養板去除非貼壁細胞，即獲得貼壁的單核細胞，每孔加1 ml CellGro-DC樹突狀細胞培養基，rhGM-CSF 100 ng/ml，rhIL-4 4500 U/ml，置37℃、5%二氧化碳孵箱培養，培養第3天每孔補加上述培養基1 ml及細胞因子，培養第7天收集懸浮細胞，即為DC。

1.5 DC形態觀察通過倒置顯微鏡每天觀察細胞活力、數量及形態變化。

1.6 混合淋巴細胞反應首先用淋巴細胞分離液分離正常人外周血單個核細胞，置37℃培養2 h后去除貼壁細胞，非貼壁細胞用10%AB血清的RPMI1640完全培養液懸浮，制備獲得同種淋巴細胞，96孔板每孔加入同種淋巴細胞5×105。DC用含10%AB血清的RPMI 1640懸浮為5×106細胞/ml，加入絲裂霉素C 25 μg/ml，37℃孵育45 min，RPMI液洗3次，用含10%AB血清的RPMI 1640培養液懸浮細胞，按DC∶T細胞不同比例(1∶10，1∶30，1∶90，1∶270)，將滅活的DC加入96孔板中與同種異體T淋巴細胞混合，每組設3個復孔，終體積為200 μl，另取3孔只加淋巴細胞而不加DC細胞，作為背景對照。置于37℃、5%二氧化碳孵箱培養96 h，于培養結束前4 h每孔加入MTT(5 mg/ml)20 μl，繼續孵育4 h，1500 r/min，離心5 min，吸去孔內液體，每孔加DMSO 200 μl，震蕩搖勻后在37℃放置0.5 h待甲臢結晶完全溶解后，用自動光譜測讀儀(molecular device)測定光密度(A)值(570 nm)，結果用3孔均值表示。

1.7 統計學處理數據采用均數±標準差表示，采用SPSS 10.0統計軟件包進行t檢驗比較治療前后的差異，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 DC體外培養生成的情況通過對≥80歲老年人胸腺肽α1治療前后外周血DC體外培養的觀察，發現治療前DC在培養過程中細胞逐漸死亡，培養孔中的細胞量逐漸較少，培養至第7天部分細胞死亡，留有少量單核樣細胞及懸浮的樹突狀形態的細胞，最終獲得的DC數量較少(圖1A)，其中有8例未能培養出DC。而治療后培養細胞的活力保持較好，至第7天全部獲得數量較多的DC(圖1B)。

圖1 體外培養第7天時生成DC的形態(×100)

2.2 DC的體外存活時間培養至第7天獲得的DC體外繼續培養，治療前DC繼續培養2 d后全部死亡，而治療后DC體外繼續培養可以保持存活5～7 d。

2.3 同種T淋巴細胞刺激能力測定刺激同種T淋巴細胞增殖能力的高低直接反映了DC的功能狀況。治療前DC刺激同種T淋巴細胞增殖能力較弱，在刺激細胞：反應細胞(S∶R)比值為1∶10時A值為0.79±0.11，而治療后A值為1.23±0.22，治療前后具有顯著的統計學差異(P＜0.05)。

3 討論

DC在先天性和獲得性免疫中扮演了重要的角色。DC是體內功能最強和最活躍的專職APC，體內分布廣泛，亞群復雜，能捕獲、處理和提呈抗原，并參與淋巴細胞激活、生長和分化，在天然免疫和獲得性免疫中均發揮著極其重要的作用，它是識別病原體侵入的第一道防線。機體的免疫識別首先由DC捕獲、加工和處理抗原，再將抗原提呈給T、B淋巴細胞，從而引發一系列免疫應答，在體內發揮強大的免疫監視功能。

增齡引起的DC功能的下降減弱了機體免疫防御及免疫監視作用，致使老年人容易患感染、腫瘤和自身免疫性疾病。老年人DC攝取抗原能力的下降減弱了它對抗原的加工和提呈，進而也影響了它激活T細胞的能力。然而目前人們對DC在免疫衰老中所起的作用還不是十分清楚。

胸腺肽α1是一種重要的免疫調節劑，能誘導T細胞的分化，促進T淋巴細胞亞群發育并活化等各種免疫效應，臨床上主要用于免疫缺陷癥和自身免疫性疾病的治療。本研究從另一途徑研究其對機體免疫增強作用。有實驗研究表明直腸腫瘤小鼠模型接受胸腺肽α1加IL-2治療后，其外周血單核細胞的數量明顯增多［7］，≥80歲老年人較普通老年人外周血培養的DC體外的生長活力、T細胞刺激能力明顯降低［8］。本研究顯示，≥80歲老年人應用胸腺肽α1后DC的活力和對同種T淋巴細胞的增殖作用明顯增強，可能的原因就是胸腺肽α1增強了外周血單核細胞的活性和(或)增多了其數量，具體的作用機制有待于進一步研究。文獻中尚沒有血型對DC刺激同種T淋巴細胞增殖能力有影響的相關報道。

本試驗發現胸腺肽α1治療后高齡老年人DC的體外培養存活時間延長，細胞活力明顯上升，培養獲得的DC數量明顯增多，刺激同種異體T淋巴細胞反應的能力也出現了一定程度的上升。

當今世界人口老齡化是一個發展趨勢，并且≥80歲老年人群在老年人群中所占的比例越來越大，≥80歲老年人的免疫功能低下致使感染性疾病的發病率明顯增加，已嚴重影響了他們的生命質量，如何減少感染性疾病的發生率，提高他們的生活質量已成為當今老年病學的一個重要的研究課題。本研究結果為進一步探究老年免疫衰老的發病機制及有效干預提供了一個可靠的實驗理論依據。

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