二烯丙基二硫下調LIMK1抑制人胃癌MGC803細胞遷移與侵襲

馬艷華，蘇 波，向姝霖，姜 浩，楊邦敏，章 碩，夏 紅，蘇 琦

(南華大學1.附屬第一醫院，2.腫瘤研究所，湖南省高校腫瘤細胞與分子病理學重點實驗室，湖南衡陽 421001)

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一。我國胃癌死亡率占惡性腫瘤死亡的23.2%，為歐美國家的4.2～8.0倍，患者就診時大多已經發生侵襲轉移，因而手術、化療、放療療效差，5年生存率低(發達國家33%，發展中國家20.5%)［1－2］。因此，開發有效、低毒的腫瘤侵襲轉移抑制劑，對提高胃癌5年生存率具有重要的意義。

研究表明［3］，二烯丙基二硫(diallyl disulfide，DADS)是大蒜中的一種脂溶性有效成分，具有抑制多種惡性腫瘤細胞增殖的作用。本實驗室已經證明，DADS可在體內外明顯誘導人胃癌細胞增殖抑制與分化，其機制與降低ALP比活性與Con A凝集率，增加與重組細胞骨架蛋白合成，恢復細胞間縫隙連接通訊功能，阻滯細胞于G2/M，調節ATR/Chk1/ Cdc25C/cyclin B1、激活p38、抑制ERK/AP-1，上調組蛋白乙?；?、p21 WAF1等有關［4－8］。并且，我們在DADS抑制人胃癌細胞增殖的蛋白質組學研究發現LIMK1明顯下調［9］。本研究在前期工作的基礎上，探討DADS對LIMK1表達在胃癌MGC803細胞遷移侵襲中的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞 人胃癌MGC803細胞系南華大學腫瘤研究所保存。培養于10%新生牛血清的RPMI 1640培養液中，在37℃、5%CO2的恒濕培養箱中，2 d傳代1次。

1.2 試劑與配制 DADS:Fluka公司產品，純度80%，與Tween80以1∶2的比例充分溶解，加入體積分數為0.90的生理鹽水稀釋100倍，作為母液保存于－20℃冰箱中。小牛血清(杭州四季青生物工程公司)，RPMI 1640培養基(Gibco公司)，Total RNA Kit(Omega公司)，RT試劑盒(Invitrogen公司)，PCR試劑為Promega公司產品。BCA蛋白定量檢測試劑盒(Pierce公司)，ECL發光檢測試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)，胰蛋白酶Amresco公司產品，LIMK1(ab39641)rabbit polycloncial antibody、β-actin為美國ABCAM公司產品。

1.3 劃痕試驗 將2×106個MGC803細胞接種在6孔板，培養至90%融合狀態，無血清培養液洗3次，加入新鮮無血清培養基;10 μl Eppendorf Tip在細胞板上劃痕，無血清培養液洗3次，加入新鮮無血清培養基;加入不同濃度DADS，37℃，5%CO2培養箱，測量0 h、24 h的劃痕距離，計算平均值與標準差，實驗重復3次。

1.4 Transwell侵襲實驗 采用孔徑8.0 μm的Transwell(3428型)(Corning公司)?；|膠準備:將凍存于－80℃冰箱的matrigel(BD公司)4℃過夜，變成液態;無血清培養基以1∶9稀釋，吸50μl均勻鋪到Transwell上室，37℃過夜，當出現“白色層”時，說明已經變為固態。在上室中加入100 μl預溫的無血清的DMEM培養基，室溫孵育30 min，使基質膠再水化，吸去剩余培養液，消化細胞，無血清培養基洗3次，調整細胞密度為1×109個·L－1;取細胞懸液100 μl加入上室，下室加入500 μl完全培養基;37℃、5%CO2孵育24 h，棄培養基，用棉簽輕輕擦拭上室細胞;取出Transwell用PBS洗2次，4%多聚甲醛固定細胞10 min，倒置，風干;加入0.1%結晶紫染色20 min，PBS洗3次，棉簽擦凈上室細胞;倒置顯微鏡隨機計數10個視野的細胞數，取均數。每組細胞設3個復孔，實驗重復3次。侵襲抑制率/%=［(對照組穿膜細胞數－處理組穿膜細胞數)/對照組穿膜細數］×100%。

1.5 RT-PCR Total RNA Kit提取細胞總RNA，在AMV酶作用下逆轉錄合成 cDNA。設計并合成PCR引物序列:β-actin:F 5'-ACA CTG TGC CCA TCT ACG AGG GG-3'，R 5'-ATG ATG GAG TTG AAG GTA GTT TCG TGG AT-3'，擴增片段367 bp; LIMK1:F5'-GGGGCATCATCAAGAGCA-3'，R5'-TGA GGGTGTTGACGGACC-5'，擴增片段138 bp。LIMK1反應條件:94℃5 min;94℃ 30 s，52.3℃ 30 s，72℃1 min，進行35個循環;72℃10 min。β-actin反應條件:94℃ 5 min;94℃ 30 s，55.0℃ 30 s，72℃ 1 min，進行35個循環;72℃10 min。PCR產物用2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，BIO-RAD凝膠成像系統拍照，AlphaImager 2200軟件掃描，相對光密度(ROD)代表基因表達豐度，以LIMK1/β-actin表達豐度計算平均光密度值。

1.6 Western blot 分別收集細胞，冰PBS洗2次，1×107個細胞加入100～150 μl裂解液(100 mmol· L－1NaCl，10 mmol·L－1Tris-HCl pH 7.6，1 mmol· L－1EDTA pH 8.0，1 mg·L－1Aprotinin，100 mg· L－1PMSF)，冰上裂解1 h，12 000 r·min－1離心10 min，吸出上清液，即細胞總蛋白。Bradford法測定蛋白質含量，分光光度計在570 nm波長處測定光吸收值，以溶劑為空白對照，牛血清白蛋白為標準繪制曲線，依據標準曲線推算蛋白質含量。收集蛋白，變性后，10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉移至PVDF膜上，含5%牛血清白蛋白的TBST(Tris-HCl 20 mmol·L－1，NaCl 137 mmol·L－1含0.1%Tween-20)封閉1 h，一抗4℃孵育過夜，TBST洗3次，每次5 min，二抗孵育1 h，TBST洗3次，每次5 min，化學發光劑檢測蛋白質印跡，薄層掃描儀測定光密度值。

1.7 統計學處理 采用SPSS13.0統計學軟件One-Way ANOVA或t檢驗進行統計學處理。

2 結果

2.1 DADS抑制人胃癌MGC803細胞增殖 Fig 1所示，30 mg·L－1DADS作用MGC803細胞24、48、72、96 h后，其抑制率分別為 31.8%、66.1%、83.6%與89.2%(P＜0.05)。表明DADS可呈時間依賴性明顯抑制人胃癌MGC803細胞增殖。

Fig 1 Effect of DADS on the proliferation of MGC803 cells *P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control

2.2 DADS對人胃癌MGC803細胞遷移能力的影響 Fig 2、3所示，DADS未處理與處理的MGC803細胞在0h劃痕距離較一致，10、20、30、40、50 mg· L－1DADS作用24 h后，細胞的劃痕距離明顯減少，表明MGC803細胞具有較強的遷移能力。而處理組較未處理組呈濃度依賴性劃痕距離明顯增加，表明DADS可抑制人胃癌MGC803細胞遷移。

2.3 DADS對人胃癌MGC803細胞侵襲能力的影響 Fig 4，5所示，10、20、30、40、50 mg·L－1DADS作用MGC803細胞24 h后，穿過基質膠的細胞數分別為(35.8±3.74)、(34.1±2.02)、(31.7±4.81)、(17.2±3.08)、(13.2±3.36)個，明顯少于對照組細胞數(39.5±2.99)個(P＜0.05)。結果表明，DADS可濃度依賴性降低人胃癌MGC803細胞的體外侵襲能力。

Fig 2 Effect of DADS on the migration of MGC803 cells(×4)

Fig 3 Effect of DADS on the migration of MGC803 cells

Fig 4 Effect of DADS on the invasion of MGC803 cells(×200)

Fig 5 Effect of DADS on the invasion of MGC803 cells

2.4 DADS對人胃癌MGC803細胞LIMK1表達影響 RT-PCR顯示，30 mg·L－1DADS處理MGC803細胞48h后，LIMIK1 mRNA明顯下降(P＜0.05)(Fig 6)。表明DADS在mRNA水平上可以抑制LIMK1表達。

Fig 6 Effect of DADS on LIMK1 mRNA expression in MGC803 cells

Fig 7 Effect of DADS on the expression of LIMK1 in MGC803 cells by Western blot

3 討論

腫瘤細胞的遷移侵襲行為是發生轉移最關鍵的因素，明確腫瘤細胞的遷移侵襲機制，抑制腫瘤細胞的遷移侵襲能力已成為近年來研究的熱點。

本研究顯示，30 mg·L－1DADS作用MGC803細胞24、48、72、96 h后，其抑制率分別為31.8%、66.1%、83.6%與89.2%，表明DADS可呈時間依賴性抑制人胃癌MGC803細胞增殖(P＜0.05)。10、20、30、40、50 mg·L－1DADS作用24 h后，細胞的劃痕距離明顯減少，穿過基質膠的細胞數明顯少于對照組(P＜0.05)，表明DADS可呈濃度依賴性降低MGC803細胞的遷移侵襲能力。

研究證明，LIMK1在多種惡性腫瘤細胞內高表達或活性增強，并通過不同機制和途徑參與腫瘤的侵襲轉移過程。LIMK1基因位于人類染色體上7q11.23，全長39 499個 bp，編碼 LIMK1蛋白。LIMK1可磷酸化Cofilin/ADF蛋白第3位的絲氨酸，磷酸化后其解聚肌動蛋白的能力消失，肌動蛋白聚合形成偽足結構，驅動腫瘤細胞遷移。因此，LIMK1對cofilin磷酸化與去磷酸化間的平衡進行微調節可能是影響腫瘤細胞遷移侵襲能力的決定性因素［10］。LIMK1的活性受多種蛋白調控，調節其活性的上下游的信號分子單獨或聯合LIMK1參與腫瘤細胞的侵襲遷移，主要受Rho-ROCK/PAK-LIMK-ADF/Cofilin信號通路調控。上調LIMK1活性的正調節蛋白包括Rac1、ROCK與PAK1、4，可使第508位的蘇氨酸殘基磷酸化而激活激酶［10－11］。許多癌基因通過調節LIMK的活性實現腫瘤細胞的遷移侵襲，如PKC zeta通過影響LIMK調節細胞骨架重組，促進人惡性膠質瘤細胞的遷移。VEGF通過MAPK途徑調節LIMK1的活性，影響肌動蛋白重組及血管內皮細胞的遷移［12］。此外，許多抑癌基因通過下調LIMK1發揮其抑癌活性。如p57通過控制LIMK1活性減少肌動蛋白周轉率，影響腫瘤細胞的遷移能力，發揮其抑癌作用［13］。近來，我們發現LIMK1在胃癌中表達明顯高于正常組織與非典型增生組織，并隨分化程度降低而增強，瘤體積≤3.0 cm的胃癌表達明顯低于＞3.0 cm，淋巴結轉移明顯高于未轉移組，TNM分期Ⅰ、Ⅱ期表達明顯低于Ⅲ、Ⅳ期。提示LIMK1與胃癌的發生、分化程度、腫瘤大小、淋巴結轉移以及臨床分期密切相關［14］。并且證明DADS可抑制人結腸癌SW480細胞遷移與侵襲，其機制與下調LIMK1有關［15］。

本研究RT-PCR顯示，30 mg·L－1DADS處理MGC803細胞48 h后，LIMIK1 mRNA明顯下降(P＜0.05)，表明 DADS在 mRNA水平上可抑制LIMK1表達。同樣，Western blot結果證明，LIMK1蛋白表達明顯下調(P＜0.05)，表明DADS可抑制MGC803細胞LIMK1蛋白表達。

綜上所述，DADS可明顯抑制人胃癌MGC803細胞遷移侵襲，可能與下調LIMK1表達有關。本研究為尋找抑制腫瘤細胞侵襲、轉移的作用靶點提供了依據。但 DADS是否通過 Rac1-Rock1/Pak1-LIMK1通路調控ADF/cofilin，抑制人胃癌細胞遷移與侵襲，其分子機制尚待進一步研究。

［1］ 孫秀娣，牧 人，周有尚，等.中國胃癌死亡率20年變化情況分析及其發展趨勢預測［J］.中華腫瘤學雜，2004，26(1):4－9.

［1］ Sun X D，Mu R，Zhou Y S，et al.Analysis of mortality rate of stomach caner and its trend in twenty years in China［J］.Chin J Oncol，2004，26(1):4－9.

［2］ Parkin D M，Bray F，Ferlay J，et al.Global cancer statistics，2002［J］.CA Cancer J Clin，2005，55(2):74－108.

［3］ Powolny A A，Singh S V.Multitargeted prevention and therapy of cancer by diallyl trislfide and related Allium vegetable-derived organosulfur compounds［J］.Cancer Lett，2008，269(2):305－14.

［4］ Yuan J P，Wang G H，Ling H，et al.Diallyl disulfide-induced G2/M arrest of human gastric cancer MGC803 cells involves activation of p38 MAP kinase pathways［J］.World J Gastroenterol，2004，10(18):2731－4.

［5］ 向姝霖，肖曉嵐，凌 暉，等.二烯丙基二硫對人胃癌細胞裸鼠移植瘤的抗腫瘤作用［J］.癌癥，2005，24(8):940－4.

［5］ Xiang S L，Xiao X L，Ling H，et al.Antitumor effect of diallyl disulfide on human gastric cancer MGC803 cells xenograft in nude mice［J］.Chin J Cancer，2005，24(8):940－4.

［6］ Ling H，Zhang L Y，Su Q，et al.Erk is involved in the differentiation induced by diallyl disulfide in the human gastric cancer cell line MGC803［J］.Cell Mol Biol Lett，2006，11(3):408－23.

［7］ 凌 暉，陸麗峰，文 玲，等.RNA干擾Chk1/2調控二烯丙基二硫誘導的G2/M期阻滯作用及相關周期蛋白表達［J］.生物化學與生物物理進展，2010，37(2):184－9.

［7］ Ling H，Lu L F，Wen L，et al.Interference of Chkl/2 by RNA regulates G2/M arrest and expressions of cell cycle related proteins induced by diallyl disulfide［J］.Prog Biochem Biophys，2010，37 (2):184－9.

［8］ Ling H，Wen L，Ji X X，et al.Growth inhibitory effect and Chk1-dependent signaling involved in G2/M arrest on human gastric cancer cells induced by diallyl disulfide［J］.Braz J Med Biol Res，2010，43(3):271－8.

［9］ 劉 瑤，向姝霖，袁靜萍，等.二烯丙基二硫誘導人胃癌MGC803細胞分化的差異蛋白質分析［J］.中國藥理學通報，2012，28(5):671－6.

［9］ Liu Y，Xiang M L，Yuang J P，et al.Proteome analysis of human gastric cancer MGC803 cells induced by diallyl disulfide［J］.Chin Pharmacol Bull，2012，28(5):671－6.

［10］馬艷華，史 玲，蘇 琦.LIM激酶與腫瘤［J］.國際病理科學與臨床雜志，2009，29(6):490－3.

［10］Ma Y H，Shi L，Su Q.LIM kinase and tumor［J］.Int J Pathol Clin Med，2009，29(6):490－3.

［11］章 碩，姜 浩，蘇 埼.Rac1與腫瘤的研究進展［J］.國際病理科學與臨床雜志，2011，31(5):410－4.

［11］Zhang S，Jiang H，Su Q.Advances in research on Rac1 and tumor［J］.Int J Pathol Clin Med，2011，31(5):410－4.

［12］Kobayashi M，Nishita M，Mishima T，et al.MAPKAPK-2-mediated LIM-kinase activation is critical for VEGF-induced actin remodeling and cell migration［J］.EMBO J，2006，25(4):713－26.

［13］Vlachos P，Joseph B.The Cdk inhibitor p57(Kip2)controls LIM-kinase 1 activity and regulates actin cytoskeleton dynamics［J］.Oncogene，2009，28(47):4175－88.

［14］吳勇軍，唐 儀，李 箏，等.胃癌中LIMK1的表達及其病理意義［J］.臨床與實驗病理學雜志，2011，27(6):658－60.

［14］Wu Y J，Tang Y，Li Z，et al.The expression of LIMK1 and pathologic significance in gastric cancer［J］.J Clin Exp Pathol，2011，27(6):658－60.

［15］史 玲，蘇 堅，廖前進，等.二烯丙基二硫下調LIMK1抑制人結腸癌SW480細胞遷移與侵襲［J］.中國藥理學通報，2011，28(2):200－5.

［15］Shi L，Su J，Liao Q J，et al.Diallyl Disulfide inhibits migration and invasion in human Colon cancer SW480 cells by downregulating expression of LIMK1［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，28 (2):200－5.