木聚糖酶微生物發酵生產的研究進展

孫孝梅，黃建忠

（1.福建師范大學生命科學學院，福建 福州 350108；2.工業微生物教育部工程研究中心，福建 福州350108；3.福建省現代發酵技術工程研究中心，福建 福州 350108）

木聚糖酶是一類可特異性降解木聚糖的酶類，主要由β－1，4－內切木聚糖酶和β－木糖苷酶組成［1］，廣泛分布在自然界中，細菌、真菌、酵母、放線菌、海洋藻類、反芻動物瘤胃、蝸牛、甲殼動物、各種無脊椎動物和陸地植物組織中都有存在［2］。木聚糖酶在半纖維多聚糖資源的利用及工業應用方面有巨大的潛力，如該酶在造紙工業中可以水解半纖維素釋放木素，可增加紙張白度，改善紙張性能，同時降低漂白時含氯化物的用量，大大減少環境污染［3］；在食品工業中可作為面包的改良劑［4］，增大面包體積，還可以利用木聚糖酶降解木聚糖生產低聚木糖等高附加值的產品［5］；在飼料工業中，木聚糖酶作為動物飼料的添加劑，可以降解植物細胞壁結構，提高飼料的轉化率，減少腸道疾病，提高動物生長性能等［6］。因此，開展木聚糖酶的開發和生產研究具有極大的商業價值和廣闊的應用前景。

而在眾多木聚糖酶來源中，人們研究和應用最多的是微生物木聚糖酶。已報道的能產木聚糖酶的微生物主要有細菌、真菌、放線菌和酵母。國內外研究較多的產木聚糖酶的微生物是木霉、青霉、曲霉、鏈霉菌等真菌和芽孢桿菌。絲狀真菌木聚糖酶的表達量往往高于細菌和酵母［7］，而且大多是胞外酶，易于發酵后的分離純化，但所產酶系較為復雜，常常伴隨高活性纖維素酶的產生。目前工業上使用的木聚糖酶也主要是利用這些微生物發酵而成。由于微生物木聚糖酶在處理半纖維素方面安全有效，因而大力尋找和開發經濟、高效的微生物木聚糖酶具有重要的意義。

1 木聚糖酶高產菌種的分離和選育

菌種的分離和選育是木聚糖酶發酵生產的基礎性工作，菌種能否成功選育是木聚糖酶能否具有工業化價值和發酵過程能否成功的關鍵因素。

1.1 菌種篩選

我國對木聚糖酶的研究起步較晚，且普遍存在生產的木聚糖酶活性較低等問題，因此，篩選木聚糖酶活性較高的生產菌種已成為研究的關鍵。產木聚糖酶的微生物種類很多，陸地及海洋微生物均有分布。自然界中的土壤是取之不盡的菌種寶庫，因此木聚糖酶生產菌株大多從富含半纖維素的土壤中分離得到，如垃圾場、造紙廠及長期堆放木聚糖含量較高的木質纖維材料土壤等。純種分離常采用平板分離法，包括劃線法和稀釋涂布法。菌種初篩通常采用透明圈法，在平板培養基中加入溶解性較差的底物（如木聚糖）作為唯一碳源，根據菌落周圍是否出現透明的水解圈及透明圈的大小來區別產酶菌株。另外，剛果紅透明圈法也是分離產酶菌株常用到的一種篩選方法。在初篩的基礎上，利用酶活測定法進行復篩，從而篩選到產酶量高且性能更符合生產要求的菌種。

陳和秀等［8］以甘蔗渣半纖維素為碳源，從垃圾場土壤中分離到一株木聚糖酶活力較高的菌株。根據對菌株形態學分析和18SrDNA序列分析的結果，將該菌株鑒定為曲霉HQ3，通過固態發酵的木聚糖酶活力最高可達3421U／g干曲。孫豐慧等［9］利用剛果紅透明圈法，從造紙廠堿性土壤中篩選到一株木聚糖酶生產菌株X24－14，經培養特性研究及16SrDNA序列比對分析，初步鑒定為纖維菌屬（Celulosimicrobium），經發酵條件優化后，該菌產生的木聚糖酶最大活力為2204U／mL，該酶最適反應溫度為60℃，具有較寬的pH作用范圍，在pH 4.2～9.4范圍內能保持較高的酶活力。張世敏等［10］采用透明圈法，從土壤中篩選到一株產酸性木聚糖酶的黑曲霉菌株F19，通過單因子及正交試驗確定了最佳產酶培養基，在最適培養條件下，搖瓶發酵的木聚糖酶活性最高為1303.56 U／mL。Dheeran P等［11］從白蟻內臟中分離到一株木聚糖酶高產菌株，經生理特征和16SrRNA序列分析，該菌株被鑒定為麻浸類芽孢桿菌（Paenibacillusmacerans），所產酶具有較好的溫度（40～90℃）穩定性和pH（3.5～9.5）穩定性，在最適溫度（60℃）和最適pH（4.5）下，其最佳酶活力為（4170±23.5）U／mg。

1.2 誘變育種

誘變育種是微生物改良的常用方法，而且是大多數工業微生物育種上最重要、最有效的技術。通常野生型的木聚糖酶生產菌株產量較低，生產能力遠遠不能滿足工業化的生產要求，有必要對其進行誘變育種，以期得到酶活較高的菌株。目前，研究者大多采用紫外線、微波、亞硝基胍、硫酸二乙酯等理化誘變方法獲得高產木聚糖酶菌株，其中紫外誘變是最常用和最有效的誘變劑之一。此外，利用多種誘變劑依次對產酶菌株進行復合誘變處理也是木聚糖酶高產菌株誘變育種中經常采用的技術。木聚糖酶誘變育種的工作主要包括誘變劑及其劑量的選擇、正突變株的篩選和高產木聚糖酶突變株產酶最佳條件的調整。近幾年來，木聚糖酶高產菌株的誘變育種得到了很大的發展。

楊健等［12］以球毛殼霉菌（chaetomiumglobosumAS3.3601）為出發菌種，通過紫外誘變的方法篩選到一株木聚糖酶高產突變株Z30－56，其最高酶活可達9850U／mL，比出發菌株AS3.3601提高53.7%，并且遺傳性能穩定。張新峰［13］等同樣采用紫外誘變技術，對嗜熱真菌（Thermomyces lanuginosusDSM10635）原生質體進行誘變處理，通過初篩和復篩，最終選育出3株遺傳性能穩定的木聚糖酶高產誘變株，木聚糖酶的酶活分別比出發菌株提高了26.5%、37.78%、28.2%。曾瑩等［14］以黑曲霉（AspergillusnigeAn54）為出發菌株，經紫外（UV）和硫酸二乙酯（DES）復合誘變處理原生質體，以nystainr和2－D－Gr為遺傳標記，定向篩選得到一株木聚糖酶高產菌株An54－A3，該突變株在以玉米芯和稻草為主要原料的基質上30℃下培養65h左右，木聚糖酶活力達4447.44 U／g鮮曲，比出發菌株的產酶能力提高45.85%。徐同寶等［15］以黑曲霉（AspergillusnigerXE6）為出發菌株，采用微波（MW）和硫酸二乙酯（DES）誘變處理，選育出一株遺傳性狀穩定的高產木聚糖酶菌株mAnl，該突變株經固態發酵，所產木聚糖酶的酶活為81151U／g，比出發菌株的酶活提高了34.88%。

1.3 基因工程育種

隨著生物技術的發展，利用基因工程手段克隆木聚糖酶的基因，然后將基因導入到合適的宿主中，并研究其基因的表達調控，不但可以大幅度提高木聚糖酶的產量，而且能夠改變酶的性質。國內外已有許多研究者將基因工程技術應用與木聚糖酶生產菌株的選育中，許多來自細菌或真菌的木聚糖酶基因被克隆并在大腸桿菌等表達系統中成功表達。其中，大腸桿菌表達系統因具有遺傳背景清晰、生產繁殖快、培養條件簡單、轉化和轉導效率高、成本低廉與可以快速大規模表達目的蛋白等優點而備受青睞。

付正等［16］利用基因工程技術將嗜熱真菌（ThermomyceslanuginosDSM10635）的木聚糖酶1YNA的基因xyl克隆到表達宿主大腸桿菌BL21（DE3）后獲得了能成功表達木聚糖酶的工程菌，該工程菌表達的木聚糖酶1YNA的最適溫度為65℃，最適pH 值為6.0，其在75℃，pH 值為6.5的條件下失活處理30min后仍殘存有30%的酶活，具有很好的熱穩定性。Kui H等［17］將NesterenkoniaxinjiangensisCCTCC AA001025的β－1，4內切木聚糖酶基因xyn11NX克隆至大腸桿菌中，并成功實現分泌表達。對重組酶酶學性質分析表明，最適反應pH值為7.0、溫度55℃。該重組酶的適用pH范圍較廣，在pH 5.0～11.0范圍內酶活較穩定。且其熱穩定性較好，該酶在60℃保溫1h后，其相對酶活仍可維持在80%以上。在90℃保溫15min后，仍可殘留40%以上酶活。

此外，利用蛋白質工程的方法可以進一步提高工程菌的表達水平和改善其熱穩定性。目前用于木聚糖酶蛋白質工程的相關技術主要有定點突變技術、木聚糖酶分子的化學修飾和蛋白質體外定向進化技術［18］。M.Ebrahimi等人［19］采用易錯 PCR和定點突變技術獲得了新型耐高溫嗜堿芽孢桿菌（Bacillushalodurans）突變株，該突變株產生的木聚糖酶在75℃條件下仍具有較高活性。

2 木聚糖酶的發酵生產

微生物木聚糖酶產量的高低不僅取決于菌種的好壞，還取決于它的發酵生產工藝。發酵工藝的選擇及優化對木聚糖酶的工業化生產具有重要的意義。目前，微生物木聚糖酶的發酵生產工藝主要有兩種：固態發酵和液態發酵。

2.1 固態發酵

固態發酵技術發展已久，早在古代中國就已經應用固態發酵技術制曲釀酒、腌制食品和肥料堆積等。利用固態發酵技術生產木聚糖酶是一項經濟實用的新型發酵技術。微生物所產木聚糖酶通常為誘導酶，許多半纖維素資源，如麩皮、玉米芯、甘蔗渣、秸稈等對某些特定微生物產酶菌株具有很好的誘導作用，固態發酵采用這些廉價的農業廢棄物為原料，發酵成本較經濟，而且操作設備簡單，生產效率高，整個生產過程中廢液少，環境污染較輕。隨著人們對節能環保問題的重視，利用固態發酵技術生產木聚糖酶具有較好的經濟和環境效益。但固態發酵在發酵過程中一些發酵參數不易控制，發酵周期較長，發酵過程易發生污染，傳質不均勻，產品回收率較低等。木聚糖酶固態發酵工藝的研究主要包括發酵培養基成分、料水比、發酵溫度、初始pH、接種量等。

周晨妍等［20］對黑曲霉產木聚糖酶的固態發酵條件進行了優化，確定了最優發酵培養基成分為麩皮：玉米芯＝5∶3、（NH4）2SO41.0%、KH2PO40.2%、CaCl20.1%、MgSO40.1%，料水比1∶1.7；最佳培養條件為接種量1.0%，pH 值為7.5，培養溫度為28℃，培養時間為60h，其間翻曲2～3次。在此最佳工藝條件下，木聚糖酶的活力可達14698.21U／g。Assamoi等［21］對Penicilliumcanescens產木聚糖酶的固體發酵條件進行了優化，該研究以顆粒大小5mm的大豆油餅為培養基碳源，并添加含有3%酪蛋白和4%Na2HPO42H2O的營養液，初始含水量為80%，30℃培養7天后，用三角瓶固態發酵的木聚糖酶酶活達到了18895±778U／g，而用塑料袋發酵產生的木聚糖酶活為9300±589U／g。Pandya［22］對實驗室選育的AspergillustubingensisJP－1菌株固態發酵產木聚糖酶條件進行了研究，確定了利用未經處理的小麥秸稈添加MS營養液為主要基質進行固態發酵生產木聚糖酶的適宜條件：pH 6.0，料水比1∶5，培養溫度30℃，在250mL三角瓶中固態培養8天后，木聚糖酶活力可達（6887±16）U／g。

2.2 液態發酵

與固態發酵相比，液態發酵在生產的過程中可實現實時檢測與自動控制，易于擴大生產規模，且不易染雜菌，生產效率高，產品的分離比較簡單，但會產生大量污水。木聚糖酶液態發酵生產中發酵效果除了受菌種自身產酶性能的影響外，主要受培養基組成成分、種齡、接種量、發酵溫度、pH、溶氧等條件的影響。研究主要通過各種試驗設計方法，如單因素試驗設計、正交試驗設計、響應面分析法等確定最優產酶培養基組成及最佳培養條件，從而提高木聚糖酶的產量。

王濤等［23］在5L發酵罐上對畢赤酵母產木聚糖酶的發酵條件進行研究，確定了5L罐發酵的最佳種齡是24h，最佳接種量是10%。通過正交設計試驗，得到5L罐發酵產木聚糖酶的工藝條件：pH值為5.5，溫度為30℃，空氣流量3L／min，攪拌轉速為300r／min，發酵130h，畢赤酵母發酵產木聚糖酶的酶活為2780U／mL。呂世鋒等［24］通過單因素試驗與響應面分析法對黑曲霉液體發酵產木聚糖酶的發酵條件進行了研究，當培養基為麩皮40g／L，（NH4）2SO44g／L，KH2PO43g／L，Mg－SO40.8g／L，吐溫－80 1g／L，初始pH 值5.0，接種量8.0%，培養溫度30℃，在此條件下發酵木聚糖酶酶活達1456.27U／mL。Nagar S等［25］對BacilluspumilusSV－85S液體深層發酵產無纖維素酶活且耐堿性木聚糖酶的發酵條件進行了研究。該研究表明，以麩皮作為培養基，接種量1%，種齡18h，pH 6.0，37℃發酵36h，所產木聚糖酶活力達到最高為（2995.20±200.00）U／mL。該酶具有很好的pH穩定性，在37℃，pH 5～11范圍內處理1h，仍殘留100%酶活力，而且所產酶無纖維素酶活性。

目前，國內外對木聚糖酶的發酵放大工藝方面的報道不多，許多研究還停留在實驗室搖瓶發酵階段。今后，應以搖瓶中最優培養條件作為小型發酵罐的初始培養條件進行初步放大，通過對小型發酵罐的發酵工藝進行優化后，逐級放大到工業規模的發酵。

3 展望

由于木聚糖酶存在較大的商業應用價值，有關木聚糖酶的微生物發酵生產一直是人們關注和研究的熱點。我國對木聚糖酶的研究起步較晚，現在仍存在出發菌種所產木聚糖酶的產量低、酶學性質不夠優良等缺陷，使其大規模工業化生產和應有范圍受到很大的限制。因此，從天然微生物中篩選高木聚糖酶產量并具有優良性狀的菌株，再通過誘變育種或結合基因工程育種手段，進一步提高木聚糖酶的表達水平就顯得尤為關鍵。另外，隨著蛋白質工程的迅速興起，也為木聚糖酶蛋白分子進行定向分子改造，并改善其相應酶學性質提供了可能。而且我國具有豐富的玉米芯、玉米秸稈、麥麩、蔗渣等富含半纖維素類農林纖維廢棄物，是一種用于生產木聚糖酶潛在的天然混合碳源，如能將其推廣應用于木聚糖酶的生產中，不僅可以降低木聚糖酶的生產成本，獲得巨大的經濟效益，還可以幫助處理農業廢棄物，保護環境。因此，通過對木聚糖酶發酵工藝的優化，提高木聚糖酶的生產力也是一個非常迫切的工作。

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