白芍提取物HPLC指紋圖譜分析

姜代勛，陳益山，鞏忠福，穆 祥，陳 武

［1．北京農學院獸醫學（中醫藥）北京市重點實驗室，北京 昌平 102206；2．中國獸醫藥品監察所，北京 海淀 100081］

白芍為毛茛科植物芍藥（Paeonia lactiflora Pall．）的干燥根，性微寒，味苦、酸，入肝經。具有平肝止痛、養血調經和斂陰止汗等功效，主要用于頭暈、脅痛、腹痛、四肢攣痛、血虛萎黃、月經不調、自汗等證［1］，為中（獸）醫臨床上最常用的中藥之一。現代研究表明，白芍具有抗炎、鎮痛、免疫調節等多種藥理作用［2－4］，其中，以白芍的抗炎作用研究引人注目［5－9］。

研究表明，白芍提取物為高效PDE4活性抑制劑［10］。通過抑制PDE4活性，可使多種炎癥和免疫細胞（如嗜中性粒細胞、巨噬細胞、T淋巴細胞及嗜酸性粒細胞等）c AMP達到足以抑制炎癥細胞活化的濃度而發揮抗炎作用。白芍提取物雖經多步操作制作而成，但對其內部成分和含量仍然未知，因此難于控制其質量。為了使其內部成分及含量以“圖譜”形式反映出來，本試驗通過用HPLC方法建立了白芍提取物的指紋圖譜，為全面控制其質量并為獸醫臨床開發新型、高效、低毒副作用的純天然抗炎中藥積累資料。

1 材料與方法

1．1 主要儀器和試劑 安捷倫1100高效液相色譜，色譜柱Eclipse XDB-C185μm，4．6×150 mm，Millipol超純水儀，日立SCR20BA高速冷凍離心機，上海精密p HS-2C型精密酸度計，ACCULAB分析電子天平。色譜乙腈（Merck），芍藥苷標準品（中國藥品生物制品檢定所），其他化學試劑均為分析純。

1．2 白芍提取物的制備 白芍提取物參考以前的方法制備［8］。簡言之，即以蒸餾水煎煮提取2次，合并煎液減壓濃縮；加入3倍量95%乙醇，充分攪拌于4℃靜置；濾取上清液用氫氧化鈉調p H值至7．5～8．0，再次靜置；濾取上清液，揮發掉乙醇，將藥液濃縮至1 g生藥／m L。

1．3 白芍提取物指紋圖譜分析 白芍提取物指紋圖譜分析參考張克榮等人的方法［11］，對白芍提取物指紋圖譜的檢測條件及其穩定性等進行研究。

1．3．1 溶液制備 精密稱取芍藥苷標準品適量，用甲醇配制成0．25 mg／m L的溶液。白芍提取物用流動相稀釋至10 mg生藥／m L，搖勻，0．22μm微孔濾膜過濾備用。

1．3．2 檢測波長選擇 取標準品和樣品溶液，分別在210 nm、230 nm、254 nm和270 nm共4個波長處檢測，同時對其進行190 nm～400 nm的全波長掃描。1．3．3 色譜條件 色譜柱Eclipse XDB-C18 5μm，4．6×150 mm。HPLC分析流動相為乙腈和水（12／88）。流速0．8 m L／min，柱溫25℃。

1．3．4 方法學考察 根據文獻［12-13］等分別對液相色譜的精密度、樣品的重復性及穩定性等進行檢測。

2 結果

2．1 運行時間 依據《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求（暫行）》，考察了運行時間為120 min的HPLC圖譜，確定60 min之后再無峰出現，因此，確定每次色譜的運行時間為60 min。

2．2 HPLC精密度試驗 取新制備的白芍提取物樣品，連續進樣5次，記錄指紋圖譜，考察色譜精密度。結果表明，5個主要色譜峰相對保留時間和峰面積比值均無明顯變化（RSD≤2．49），符合指紋圖譜技術要求（RSD均在3以內），表明儀器具有良好的精密度。結果見表1。

2．3 白芍提取物重復性試驗 取同一白芍飲片，稱取5份，以相同方法制備進行測定，考察色譜峰的相對保留時間、相對峰面積的一致性。結果表明，5個主要色譜峰的相對保留時間和峰面積的比值沒有顯著變化（RSD≤2．72），達到色譜指紋圖譜要求（RSD在3以內），提示樣品和儀器的重現性良好。結果見表2。

2．4 白芍提取物穩定性試驗 取一新制備的白芍提取物樣品，分別在0、12、24、48、72 h進樣，記錄指紋圖譜，檢測樣品的穩定性。結果表明，各5個主要色譜峰的相對保留時間和相對峰面積比值基本一致（RSD≤2．96），符合指紋圖譜要求（RSD 在3以內），表明樣品的穩定性良好。結果見表3。

表1 HPLC精密度試驗結果

表2 白芍提取物重復性試驗結果

表3 白芍提取物穩定性試驗結果

2．5 白芍提取物指紋圖譜 見圖1、2。

由圖1可見，白芍提取物主要存在峰1至峰5共5種成分，其中第4峰經與對照品芍藥苷比較鑒定為芍藥苷。210 nm、254 nm、270 nm處各色譜圖與230 nm檢測結果基本一致，但峰面積、峰高較小，不能準確積分，而以230 nm檢測，峰面積、峰高較大，峰數多，故最適合作白芍提取物指紋圖譜的檢測波長。

由圖2可知，白芍提取物5種主要成分紫外吸收圖譜類似，提示其存在同一官能基團。

3 討論

中藥成分復雜，以少數指標性成分控制產品質量不能體現其整體性，因而如何對中藥制劑進行整體質量控制是目前中藥研究的熱點問題［14］。中藥的質量控制是中藥現代化的一個重要組成方面，中藥指紋圖譜作為中藥質量穩定性的重要檢定方法，在中藥制劑的質量評價和中藥生產的質量控制中有著廣泛的應用［15－16］。指紋圖譜技術可整體上反應內在成分的情況，有可能最大化的獲得藥品內在質量的信息，并可指導生產企業對原料、半成品及成品進行質量控制，將中藥制劑成分含量的波動控制在一定范圍內，盡可能縮小各批次間的差異，以保證產品質量的穩定和均一。

白芍主要含有芍藥苷、芍藥內酯苷、苯甲酰芍藥苷、去苯甲酰芍藥苷、沒食子酰芍藥苷等單萜苷類；沒食子酸、沒食子酸甲酯、沒食子酸乙酯、兒茶素、五沒食子酰葡萄糖等鞣質類成分［17］。此外，尚含有苯甲酸、β－谷甾醇、揮發油、脂肪油、樹脂、糖、淀粉、黏液質、蛋白質和三萜類成分。

根據試驗結果，色譜儀的精密度、白芍提取物樣品的重復性及穩定性均符合指紋圖譜要求。由圖可見，白芍提取物在不同波長各峰分離度均較好，但以230 nm檢測，峰面積、峰高較大，峰數較多。從指紋圖譜可見白芍提取物主要存在5種成分，因僅獲得標準品芍藥苷，鑒定出第4峰為芍藥苷，其他4種成分正在進一步鑒定中。另外，我們通過試驗發現芍藥苷對PDE4活性影響較小，因而其余4種成分的分離及鑒定有助于從白芍提取物中發現新的高效PDE4活性抑制劑，有利于新型抗炎藥的研發。鑒于白芍提取物在動物炎癥模型上顯示的良好抗炎作用［8－9］，提示其有望成為用于獸醫臨床的一種新型純中藥抗炎藥，但對于它的安全性及其臨床療效等仍需進一步研究。

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