亞硒酸鈉對(duì)雌鼠生殖系統(tǒng)毒性作用的研究

韓 玉，侯振中

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

硒是生物體內(nèi)必需的一種微量元素，它是谷胱甘肽過氧化物酶活性中心的組成成分［1］。硒作為一種添加劑已經(jīng)被廣泛應(yīng)用，目前對(duì)于補(bǔ)硒及硒對(duì)機(jī)體的良性作用的研究已經(jīng)到達(dá)一定的深度和廣度［2－3］，而對(duì)于低毒劑量硒與雌性動(dòng)物生殖系統(tǒng)的作用關(guān)系研究較少。硒的安全劑量和中毒劑量閾值非常小［4］，人們?cè)谧⒅貏?dòng)物補(bǔ)硒的同時(shí)，往往控制不好硒的用量，有研究表明，對(duì)硒治療性的攝入也可導(dǎo)致硒中毒［2］，因此補(bǔ)硒不當(dāng)或略有過量，或長(zhǎng)期補(bǔ)硒有可能對(duì)生殖系統(tǒng)造成一定毒性作用，對(duì)此尚缺乏詳細(xì)研究。本試驗(yàn)用亞硒酸鈉對(duì)雌性小鼠按不同劑量灌胃，通過30 d亞急性中毒試驗(yàn)建立雌性小鼠硒中毒的動(dòng)物模型，探索微量元素硒對(duì)雌性小鼠生長(zhǎng)發(fā)育、生殖系統(tǒng)組織病理學(xué)變化、生殖系統(tǒng)組織硒含量和血清谷胱甘肽過氧化物酶等相關(guān)參數(shù)的影響規(guī)律，探討硒對(duì)雌性小鼠生殖系統(tǒng)的毒性作用，為硒的正確使用提供可靠的科學(xué)依據(jù)，為硒的生殖毒理學(xué)研究補(bǔ)充資料。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組 將6周齡昆明系雌性小鼠40只，經(jīng)1周適應(yīng)性飼養(yǎng)，隨機(jī)分為對(duì)照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組4組，每組10只。

1.2 主要試劑及儀器 亞硒酸鈉（化學(xué)純，批號(hào)：2009-3-13，上海三浦化工有限公司生產(chǎn)）、DAN（南京建成生物工程研究所）、谷胱甘肽過氧化物酶活性試劑盒（南京建成生物工程研究所），其余試劑均為分析純。

HH601型恒溫水浴鍋，LDZ5-2型普通離心機(jī)，熒光分光光度計(jì)，042296型電子分析天平，常規(guī)外科手術(shù)器械和電子顯微鏡。

1.3 小鼠亞急性硒中毒動(dòng)物模型的建立 急性硒中毒試驗(yàn)測(cè)得LD50為10.8 mg／kg。對(duì)照組蒸餾水灌胃，3個(gè)染硒組分別按0.135 mg／kg（1／80LD50）、0.54 mg／kg（1／20LD50）、2.16 mg／kg（1／5LD50）亞硒酸鈉灌胃。4組試鼠均自由采食，自由飲水。連續(xù)灌胃30 d。

1.4 檢查內(nèi)容 0 d和第30天對(duì)小鼠進(jìn)行稱重測(cè)其生長(zhǎng)情況，觀察其發(fā)病情況和死亡狀況，計(jì)算其蓄積系數(shù) K，K＝LD50（n）／LD50（1）［5］；第30天殺鼠取樣，摘取生殖器官（卵巢、子宮）稱重，卵巢指數(shù)（Ovaries Index，OI）＝卵巢質(zhì)量／體重（mg／g），子宮指數(shù)（U-terus Index，UI）的檢測(cè)同卵巢指數(shù)［6］；電子顯微鏡下觀察卵巢、子宮組織病理學(xué)變化；用原子熒光分光光度計(jì)測(cè)子宮、卵巢組織硒含量；用谷胱甘肽過氧化物酶活性試劑盒檢測(cè)血清中谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）活性。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法 數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，樣品均數(shù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（±S）表示。

2 結(jié)果

2.1 小鼠硒中毒動(dòng)物模型的建立 對(duì)照組小鼠在試驗(yàn)期間食欲正常，精神良好，個(gè)體增重穩(wěn)定。染硒組小鼠在試驗(yàn)初期精神良好，第6天時(shí)發(fā)現(xiàn)部分小鼠皮膚松弛，背毛凌亂，食欲減損；隨染硒時(shí)間延長(zhǎng)，低、中、高組小鼠出現(xiàn)不同程度的精神不振、行動(dòng)遲緩、背毛凌亂、脫毛、體重下降等情況。試驗(yàn)期間未見小鼠死亡。30 d后剖檢可見小鼠肝臟腫大、充血，脾臟腫大、充血，個(gè)別小鼠子宮出現(xiàn)炎性腫脹、子宮積液。計(jì)算其蓄積系數(shù)K＝12，屬于弱蓄積性物質(zhì)。

2.2 亞硒酸鈉對(duì)雌性小鼠體重增長(zhǎng)狀況及臟器系數(shù)的影響 初始體重差別極小的情況下，整個(gè)試驗(yàn)階段各組小鼠平均體重都隨時(shí)間在增長(zhǎng)，隨著染毒劑量增大及時(shí)間的延長(zhǎng)，平均體重增幅逐漸減小，偶見個(gè)別小鼠體重降低或增重停滯現(xiàn)象。

第30天剖檢小鼠時(shí)發(fā)現(xiàn)對(duì)照組的卵巢指數(shù)與高劑量組差異極顯著（P＜0.01），對(duì)照組子宮指數(shù)與中劑量組差異極顯著（P＜0.01），與其他兩組差異顯著（P＜0.05），隨著染毒劑量增加，卵巢指數(shù)下降，而子宮指數(shù)先升高后降低（見表1）。

表1 小鼠體重狀況（g）及卵巢、子宮指數(shù)（mg／g）（n＝10）

2.3 卵巢、子宮的組織病理學(xué)變化 電鏡下觀察卵巢超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組卵巢顆粒細(xì)胞內(nèi)核膜完整，結(jié)構(gòu)清晰，各細(xì)胞器完整，未見異常變化；低劑量組顆粒細(xì)胞核膜間隙大，核仁有的凝聚成團(tuán)，部分線粒體空泡變性；中劑量組顆粒細(xì)胞變形，出現(xiàn)核膜溶解現(xiàn)象，線粒體數(shù)目稀少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，呈現(xiàn)凋亡細(xì)胞的變化；高劑量組顆粒細(xì)胞嚴(yán)重變形，核膜皺縮，線粒體腫脹，有空泡形成，凋亡細(xì)胞數(shù)目增多。觀察子宮超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組子宮腺上皮細(xì)胞表面有大量發(fā)育良好的微絨毛，細(xì)胞核完整規(guī)則，各細(xì)胞器完整，未見異常；低劑量組子宮腺上皮細(xì)胞微絨毛變短，部分細(xì)胞出現(xiàn)核仁濃縮，細(xì)胞器發(fā)育較好；中劑量組子宮腺上皮細(xì)胞表面微絨毛稀少，細(xì)胞核膜內(nèi)陷、核仁濃聚，有線粒體腫脹變形，溶酶體明顯增多；高劑量組子宮腺上皮細(xì)胞微絨毛稀少、短小，核膜深度皺縮，有的消失，僅存核仁和核內(nèi)的假包含物，線粒體變形。

2.4 雌性小鼠血清GSH-PX及卵巢、子宮硒含量的測(cè)定 染毒組血清中谷胱甘肽過氧化物酶的比活力極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），隨染硒劑量呈先升高后降低的趨勢(shì)。中、高劑量染毒組卵巢硒含量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05或P＜0.01），3個(gè)染毒組子宮硒含量均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05或P＜0.01），卵巢、子宮硒含量隨染硒劑量的增加而增加，呈劑量效應(yīng)關(guān)系（見表2）。

表2 血清GSH-PX及雌鼠卵巢、子宮硒含量

3 討論

硒是機(jī)體必需的微量元素之一，但高硒作用于機(jī)體一定時(shí)間即可以產(chǎn)生不同程度的毒性作用，對(duì)機(jī)體造成危害。胡濱［7］等研究結(jié)果表明，毒性劑量硒對(duì)小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育有阻滯作用。本試驗(yàn)分別用0.135 mg／kg（1／80LD50）、0.54 mg／kg（1／20LD50）、2.16 mg／kg（1／5LD50）的亞硒酸鈉對(duì)雌性小鼠灌胃30 d。第20天時(shí)染硒組小鼠即出現(xiàn)毛發(fā)凌亂、脫毛、皮膚松弛、精神不振等癥狀。第30天時(shí)染硒組小鼠出現(xiàn)行動(dòng)遲緩、食欲不振等癥狀，個(gè)別小鼠出現(xiàn)神經(jīng)癥狀和體重下降等現(xiàn)象。染硒期間未見小鼠死亡。染硒組體重增幅比對(duì)照組低。隨著染硒劑量增加，卵巢指數(shù)逐漸下降，而子宮指數(shù)先下降后升高，可能由于高硒作用于生殖系統(tǒng)，阻礙卵巢生長(zhǎng)，導(dǎo)致卵巢發(fā)育不良，而子宮發(fā)生炎性腫脹導(dǎo)致指數(shù)升高。電鏡下超微結(jié)構(gòu)觀察顯示，染硒組小鼠子宮、卵巢的細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的核仁濃縮、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出現(xiàn)空泡變性、線粒體腫脹變形、凋亡細(xì)胞數(shù)目增多等情況，說(shuō)明0.135 mg／kg（1／80LD50）濃度的硒已經(jīng)對(duì)小鼠造成了生殖系統(tǒng)的損害，成功建立了亞急性中毒小鼠模型。

硒是動(dòng)物體內(nèi)谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的結(jié)構(gòu)成分之一，因此谷胱甘肽過氧化物酶也是衡量機(jī)體內(nèi)硒含量的一個(gè)重要指標(biāo)［8］。但GSH-PX活性并不會(huì)隨硒水平升高而無(wú)限升高［9］。葉遠(yuǎn)森［10］等測(cè)定高硒綿羊全血GSH-PX活性，發(fā)現(xiàn)給硒后20～30 d明顯升高，40 d達(dá)到頂峰，動(dòng)物中毒后，GSH-PX活性開始明顯下降。劉明寶［11］研究報(bào)告表明，大鼠全血GSH-PX活性與飼料硒水平呈線性增長(zhǎng)趨勢(shì)（r＝0.888，P＜0.05），大約反應(yīng)開始60 d時(shí)，血GSH-PX活性維持最高增長(zhǎng)，之后則下降。徐輝碧等［12］人研究表示，機(jī)體內(nèi)硒的生物效應(yīng)、ROS的含量與硒濃度三者呈倒置Weinberg曲線型，高硒濃度范圍內(nèi)硒生物效應(yīng)表現(xiàn)為毒性作用。本試驗(yàn)表明，隨著給硒劑量升高，子宮、卵巢組織內(nèi)硒含量也隨之升高，呈劑量效應(yīng)關(guān)系。而染硒組GSH-PX活力整體水平極顯著高于對(duì)照組（P＜0.1），在給藥劑量為0.135mg／kg時(shí)達(dá)最高點(diǎn)，之后隨給硒劑量升高而逐漸下降。說(shuō)明當(dāng)體內(nèi)硒到達(dá)一定濃度以后，并不與GSH-PX完全結(jié)合，還可能由于給硒濃度過高，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)與功能遭到破壞，高硒可能使蛋白質(zhì)過度氧化而使酶失去生物學(xué)活性。有研究表明，在缺硒狀態(tài)下GSH-PX活力可以作為衡量機(jī)體硒水平的標(biāo)準(zhǔn)［13］，但在本試驗(yàn)中，可得出高硒狀態(tài)下GSH-PX活力與給硒劑量具有明顯負(fù)相關(guān)趨勢(shì)，但因給硒劑量分組少，尚不能確實(shí)建立相互間的完整相關(guān)性，需進(jìn)一步研究。

綜上所述，高劑量硒會(huì)阻滯雌性小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育，作用于生殖系統(tǒng)造成一定的毒性作用，對(duì)其有弱蓄積作用并呈劑量效應(yīng)關(guān)系，其蓄積系數(shù)K＞5，屬于弱蓄積性物質(zhì)。因此補(bǔ)硒時(shí)要嚴(yán)格控制用量，不能添加過多，否則會(huì)對(duì)動(dòng)物機(jī)體帶來(lái)?yè)p害。用谷胱甘肽過氧化物酶作為衡量硒的標(biāo)準(zhǔn)這一問題仍有待研究。

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