納洛酮對小型豬特異性麻醉劑麻醉大鼠大腦皮質(zhì)C－jun mRNA表達的影響

尹柏雙，李小波，石星星，李志強，范宏剛，高 利，王洪斌

（1.東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.吉林農(nóng)業(yè)科技學院動物醫(yī)學學院，吉林 吉林 132101）

近年來研究發(fā)現(xiàn)，即刻早期原癌基因C－jun可由于刺激等活動而立即轉(zhuǎn)錄出C-jun mRNA，翻譯為JUN核蛋白，與FOS蛋白結(jié)合后被視為在外界刺激－轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的信息傳導過程中起著核內(nèi)第三信使的作用［1］，調(diào)節(jié)其他靶基因，參與細胞內(nèi)信號級聯(lián)放大過程［2］，參與重要腦功能活動的信號轉(zhuǎn)導和調(diào)控過程［3］。研究發(fā)現(xiàn)硫噴妥鈉［4］、異丙酚［5］等麻醉劑對大鼠腦區(qū)C-jun表達影響顯著。納洛酮（Naloxon）是人工合成的阿片類受體頡頏劑，對嗎啡、芬太尼和卡芬太尼的麻醉有部分頡頏作用［6－7］，對芬太尼和嗎啡誘導引起的腦損傷起到保護作用［8］，對藥物濫用、酒精成癮、休克、腦和心臟局部缺血等一些病理學疾病有治療作用［9］。本實驗室以納洛酮作為主要成分研制合成了小型豬麻醉劑（XFM）的特異性頡頏劑，臨床試驗表明，研制的頡頏劑對XFM麻醉小型豬及大鼠催醒效果顯著，對麻醉動物心、腦、血液生理指標無不良影響［10－12］。本試驗利用實時定量PCR方法研究納洛酮對大鼠大腦皮質(zhì)C-jun mRNA表達的影響，探討納洛酮對XFM催醒的部分機理。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 Trizol RNA提取試劑，購自上海閃晶生物技術研究所；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自北京全式金生物技術有限公司；SYBR?GreenⅡ，購自寶生物工程（大連）有限公司；納洛酮，購自美國輝瑞動物保健品有限公司；XFM（東北農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)外科教研室配制，批號：071221）；Roche light Cycler 2.0定量PCR儀。

1.2 試驗動物及分組 SD純種大鼠，78只，雌雄兼?zhèn)洌w質(zhì)量220±20 g，12～15周齡。隨機分為空白對照組和試驗組，試驗組被分為XFM對照組、XFM＋納洛酮組、XFM＋生理鹽水組，每組大鼠按采樣時間點被隨機分成4個亞組。試驗動物在同一條件下飼養(yǎng)，試驗前將大鼠安置在安靜、避強光的環(huán)境中飼養(yǎng)24 h以上。XFM對照組大鼠分別腹腔注射XFM（34.62 mg／kg），在翻正反射后10、20、40、60 min設為4個亞組。XFM＋納洛酮組、XFM＋生理鹽水組大鼠，先腹腔注射XFM，待翻正反射出現(xiàn)時即刻分別腹腔注射納洛酮（0.15 mg／kg）和等量生理鹽水，分別在第2次給藥后10、20、40、60 min設為4個亞組。

1.3 引物的設計與合成 根據(jù)GenBank中大鼠C－jun mRNA序列（NM021835.3）和actin mRNA序列（NM031144.2），應用Primer 5.0軟件分別設計一對特異性引物，C-jun基因上游引物為5′-GGCTGTTCATCT GTTTGTCTT-3′，下游引物為5′-GCCGCTCGCCTATTTCC-3′，actin基因上游引物為5′-GGAG ATTACTGCCCTGGCTCCTA-3′，下游引物為5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3′，由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.4 檢測方法

1.4.1 腦組織中總RNA提取與鑒定 試驗大鼠分別在上述4個時間點斷頭取腦，在生理鹽水冰面上迅速分離大腦皮質(zhì)，稱重后剪碎放入玻璃研磨器中，參照Trizol一步法操作步驟提取總RNA。利用紫外分光光度計測定總RNA在260 nm和280 nm波長下的光密度，計算 OD260／OD280比值，分析RNA純度。提取總RNA后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，確定提取的總RNA完整性。

1.4.2 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈 以Oligo（d T）18為逆轉(zhuǎn)錄引物，提取的總RNA為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶作用下，合成與mRNA互補的單鏈cDNA。反應體系及反應條件建立參照全式金反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書（編號：AT301）。

1.4.3 RT-PCR檢測大腦皮質(zhì) C-jun m RNA 定量反應條件的建立：目的基因和內(nèi)參基因定量PCR反應體系構(gòu)建參照SYBR?GreenⅡ試劑盒說明操作。擴增程序（Stage 1：95℃，30 s，20℃／s，1 Cycle；Stage 2：95℃，5 s，20℃／s，45 Cycles；Stage 3：95℃，0 s，20℃／s，65℃，15 s，20℃／s，95℃，0 s，0.2℃／s）按照引物特性設計。

標準曲線反應體系建立：隨機取一管c DNA，然后用雙蒸水按100、101、102、103、104梯度稀釋，對應的管家拷貝數(shù)分別為：107／m L、106／m L、105／m L、104／m L、103／m L，然后各取2μL進行 RT-PCR反應，擴增程序同上。以起始模板數(shù)的對數(shù)為y軸，循環(huán)數(shù)為x軸做回歸，建立標準曲線。

1.5 統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)采用相對定量2－ΔΔCt表示，結(jié)果以均數(shù)±標準差（±S）表示，用SPSS 13.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，組間比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 提取大腦皮質(zhì)總RNA質(zhì)量鑒定結(jié)果 提取的總RNA經(jīng)紫外分光光度計檢測，其OD260／OD280＝1.87，說明提取的RNA有較好的純度。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，提取的RNA完整性較好（見圖1）。

圖1 RNA電泳結(jié)果

2.2 目的基因RT-PCR溶解曲線結(jié)果 SYBR?GreenⅡRT-PCR后進行溶解曲線分析，結(jié)果見圖2。C-jun m RNA產(chǎn)物的熔解溫度為89.5℃，只有一個特異性峰，無引物二聚體和非特異性產(chǎn)物形成，說明所設計引物有很好的特異性，PCR反應條件得到了較好優(yōu)化。

2.3 目的基因RT-PCR標準曲線結(jié)果 按照1.4.3試驗步驟進行定量擴增，檢測結(jié)果以起始模板數(shù)的對數(shù)為y軸，循環(huán)數(shù)為x軸做回歸，建立標準曲線。回歸方程為Y＝ －3.845X＋29.734，R2＝0.9998（見圖3）。標準曲線回歸相關系數(shù)較高，起始模板濃度與循環(huán)數(shù)（Ct值）之間呈良好的線性關系（見圖4）。

2.4 納洛酮對大鼠大腦皮質(zhì)C－jun m RNA表達的影響 結(jié)果見表1所示。大鼠腹腔注射XFM后引起大腦皮質(zhì)C－jun mRNA高效表達，各時期C－jun m RNA表達與空白對照組比較差異極顯著（P＜0.01）；納洛酮注射后引起XFM麻醉大鼠大腦皮質(zhì)C-jun mRNA表達量減少，與XFM對照組比較差異極顯著（P＜0.01）；XFM麻醉大鼠腹腔注射生理鹽水后各時期C-jun mRNA表達與XFM對照組比較無顯著差異（P＞0.05），表明第2次注射刺激對大鼠麻醉后C-jun mRNA表達無顯著影響，證明了納洛酮對C－jun mRNA表達的影響與第2次注射刺激無關，完全是納洛酮作用引起的。

表1 納洛酮對大鼠大腦皮質(zhì)C－jun mRNA表達的影響±S，n＝6）

＃＃：表示XFM組與空白對照組比較差異極顯著（P＜0.01）；＊＊：表示藥物組與XFM對照組比較差異極顯著（P＜0.01）

3 討論

盡管脂質(zhì)學說及蛋白學說是以前全麻機理研究的主要內(nèi)容，但兩種學說不足以揭示全麻機理，結(jié)合目前麻醉學基因研究方面的進展，提出基因?qū)W說并對其進行深入的研究有助于揭示全麻與催醒的機理。C-jun是原癌基因家族成員之一，在中樞神經(jīng)網(wǎng)絡上，刺激等活動迅速引起C-jun基因的一過性表達，翻譯為JUN核蛋白，與FOS蛋白結(jié)合后返回核內(nèi)對其他靶基因轉(zhuǎn)錄進行調(diào)節(jié)［13］。C-jun基因作為麻醉相關基因被廣泛研究，近來研究發(fā)現(xiàn)，硫噴妥鈉能引起中樞神經(jīng)元多個核團jun蛋白的明顯表達，推論這些核團可能是全麻藥物中樞作用點［4］；許霽虹［14］等試驗發(fā)現(xiàn)，異丙酚能降低應激大鼠大腦皮質(zhì) C-jun m RNA 和c-fos m RNA 表達水平。

C－jun基因表達適用于神經(jīng)系統(tǒng)功能活動的定位研究，可以檢測麻醉藥在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用部位［15］。但C－jun基因的表達易受其他非試驗因素的干擾，為排除干擾性刺激對試驗結(jié)果的影響，本試驗采取以下措施：（1）大鼠于試驗前放置在安靜、溫暖和避強光的飼養(yǎng)環(huán)境內(nèi)48 h以上。（2）在試驗操作時力求輕柔，盡量保持大鼠基礎狀態(tài)的穩(wěn)定。（3）本試驗設置嚴格的XFM對照組，對照組動物與試驗組除缺少第二次給藥刺激因素不同外，其他條件均完全相同。（4）試驗設立了XFM＋生理鹽水組，通過試驗結(jié)果判斷第二次注射刺激是否引起cfos mRNA表達，以排除針刺注射對藥物作用的影響。（5）所有的大鼠，從取材，RNA提取，鑒定，反轉(zhuǎn)錄，再到實時PCR測定的操作等過程均由一個人完成，最大限度的減少試驗中的操作誤差。

本試驗以建立的XFM麻醉大鼠為動物模型，腹腔注射納洛酮后，研究納洛酮對大鼠大腦皮質(zhì)C-jun m RNA表達的影響，探討納洛酮催醒XFM麻醉大鼠的部分機理。試驗結(jié)果表明，納洛酮注射給藥后抑制了XFM誘導大鼠大腦皮質(zhì)C-jun mRNA表達，頡頏了XFM麻醉劑對大腦皮質(zhì)的刺激，減少C－jun基因表達，暫時性地阻斷了C-jun蛋白作為第三信使傳遞麻醉信號，而達到催醒作用。

4 結(jié)語

研究表明，大腦皮質(zhì)C-jun基因參與了納洛酮催醒XFM麻醉作用。納洛酮抑制XFM誘導大鼠大腦皮質(zhì)C-jun mRNA表達，阻斷XFM麻醉劑引起的中樞信號傳遞，是納洛酮催醒XFM麻醉大鼠的重要機理之一。

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