豬鏈球菌的分離鑒定及對常用抗菌藥物的耐藥性

劉 靜，李賢賢，張 鵬，王淑杰，吳 悅，趙玉蓮，李 鶴，李艷華

（1.東北農業大學 動物醫學學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.黑龍江省農墾北安管理局動物衛生監督所，黑龍江 北安 164095；3.中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所，黑龍江 哈爾濱 150030）

豬鏈球菌病是一種人畜共患的傳染性疾病，在世界上廣泛分布，是由C、D、L群鏈球菌引起的豬多種疾病的總稱，在臨床上主要表現為敗血癥、腦膜炎、關節炎、淋巴結膿腫等癥狀。其中，豬鏈球菌是引起豬鏈球菌病最主要的病原，引起豬腦膜炎以及敗血癥等疫病，人通過特定的傳播亦可感染該菌［1－2］。近幾年來，隨著我國養豬業集約化程度的不斷提高，豬鏈球菌病發生呈明顯上升趨勢，且常與豬繁殖障礙及呼吸道綜合征、豬附紅細胞體病、非典型豬瘟、豬圓環病毒病混合感染，一旦發生很難控制，給我國養豬業帶來巨大的經濟損失［3］。雖然理論上有很多藥物能治療豬鏈球菌病，但隨著抗菌藥物的廣泛使用以及不合理用藥，使得病原菌的耐藥現象日趨嚴重［4－5］。為此，我們對黑龍江省某豬場采集的豬鼻腔棉拭子進行豬鏈球菌分離純化、生化鑒定和PCR鑒定，并對分離菌進行了藥敏試驗，以期為豬鏈球菌病的防治工作提供依據。

1 材料與方法

1.1 菌株及病料 標準2型豬鏈球菌菌株ATCC700794、ATCC19714，購自美國疾病控制中心。病料系從黑龍江省某豬場通過滅菌棉拭子采集的豬鼻腔分泌物。

1.2 培養基 腦心浸液肉湯培養基、腦心浸液瓊脂，購自中國檢驗檢疫科學研究院北京陸橋生物技術有限責任公司，生化反應管購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.3 藥物 青霉素 G（Penicillin G，PEN）、阿莫西林（Amoxicillin，AMO）為東北制藥總廠生產；頭孢唑啉（Cefazolin，CEZ）、頭孢噻呋（Ceftiofur，CEF）、頭孢西丁（Cefoxitin，FOX）為石藥集團中潤制藥（內蒙古）有限公司生產；紅霉素（Erythromycin，ERY），購自武漢遠鴻科技開發有限公司；氧氟沙星（Ofloxacin，OF），購自河南康泰藥業有限公司；磺胺甲口惡唑（Sulfamethoxazole，SMZ），購自上海元越化工有限公司。上述藥品配制成一定濃度后于－20℃保存，1周內使用，臨用前稀釋成使用濃度。8類抗菌藥物試驗所用藥敏紙片，購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.4 分離鑒定

1.4.1 細菌分離純化 用無菌接種環蘸取病料接種于匹克氏肉湯中培養，37℃培養24 h后，將其接種于腦心浸液瓊脂平板上，再次置37℃培養24 h后，挑取平板上表面光滑、灰白透明單個可疑菌落接種于腦心浸液肉湯做純培養，37℃培養24 h后，進行革蘭染色，觀察其形態和染色特性。

1.4.2 生化試驗 用分離菌純培養物分別接種于乳糖、蔗糖、山梨醇、棉子糖、葡萄糖、甘露醇、菊糖、水楊苷、七葉苷、馬尿酸鹽、蕈糖、6.5%NaCl等微量生化反應管中，37℃培養24 h后，觀察其生化反應特性。

1.4.3 PCR鑒定 參照文獻［6］合成引物，gdh U：5′-GCAGCGTATTCTGTCAAAC G-3′ 和 gdh L：5′-CCATGGACAGATAAAGATGG-3′，擴 增 片 段大小為688 bp，對10株分離株分別進行gdh基因檢測。PCR 反應條件為：95℃ 變性5min；94℃45 s，55℃45 s，72℃30 s，30個循環；最后72℃延伸10 min，PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。1.5 藥敏試驗

1.5.1 K-B試驗 采用K-B紙片法。將分離的豬鏈球菌接種于腦心浸液肉湯培養基中，37℃過夜培養。比濁法將菌液濃度先調整為0.5麥氏單位（1.5×108CFU／m L），然后用腦心浸液肉湯培養基稀釋至濃度約為1.5×105CFU／m L。取1.5×105CFU／m L菌液100μL接種于腦心浸液瓊脂平板上，用涂布棒均勻涂開，

然后將藥敏紙片貼于平板上，兩片之間的距離以1～2 cm為宜，紙片距平皿邊緣約1.5 cm，置于37℃培養箱培養18～24 h后，測定抑菌圈的直徑，并用美國NCCLS標準（1999～2001）對結果進行判定［7］。

1.5.2 體外最小抑菌濃度（MIC）測定 嚴格按照NCCLS標準［7］推薦的標準微量稀釋法進行，首先將分離的豬鏈球菌菌液濃度調整為0.5麥氏單位（1.5×108CFU／m L），然后用腦心浸液肉湯培養基稀釋至濃度約為1.5×105CFU／m L后，將菌液接種于含不同藥物濃度的96孔板中，37℃培養18～24 h，觀察結果，計算細菌對各抗菌藥物的耐藥率。

2 結果

2.1 分離培養及染色鏡檢 從采集的病料中分離得到10株革蘭陽性球菌，分別將其編號為：1，2，3，4，5，6，7，8，9，10。分離菌在腦心浸液瓊脂平板上菌落呈半透明、表面光滑、微隆起的淡灰白色狀的小菌落；鏡檢呈單個、成雙或短鏈狀排列的革蘭陽性球菌。

2.2 生化試驗 對分離到的10株革蘭陽性球菌進行生化試驗，生化反應結果均符合豬鏈球菌的生化特性，鑒定結果見表1。

表1 生化試驗結果

2.3 PCR鑒定結果 以分離株基因組DNA為模板經PCR檢測后，10株分離菌株gdh基因的檢測結果均為陽性（圖1），確定為豬鏈球菌。

2.4 藥敏試驗結果

圖1 豬鏈球菌菌種PCR鑒定結果

2.4.1 K-B試驗結果 分離自豬場的10株豬鏈球菌對各抗菌藥物的耐藥結果顯示，所有的菌株對8種藥物有不同程度的敏感性，但所有的菌株均對青霉素G、阿莫西林敏感；而對頭孢西丁、紅霉素、磺胺甲口惡唑3種藥物100%耐藥。結果見表2。

表2 10株豬鏈球菌分離株的藥敏檢測結果

2.4.2 體外最小抑菌濃度的結果 根據NCCLS的判斷標準，試驗統計結果顯示，8種抗生素中，對豬鏈球菌抑菌作用最強的是青霉素G、阿莫西林，高度敏感株達100%。頭孢唑啉、頭孢噻吩對菌株敏感度在40%～80%之間。而頭孢西丁、紅霉素、氧氟沙星、磺胺甲口惡唑敏感度為0%。結果見表3。

表3 8種抗菌藥物對10株豬鏈球菌分離株的MIC測定結果

3 討論

本試驗從采集的豬鼻腔分泌物中分離到的10株細菌，根據培養特性、染色特點、形態觀察、生化試驗及PCR鑒定確定為豬鏈球菌。本試驗表明該豬場已出現豬鏈球菌感染。豬鏈球菌是一種能引起人、豬和其他動物感染、發病的重要致病菌。據報道，豬鏈球菌血清1（14）、2（1／2）、7、9型是病豬中經常流行的血清型，其中以2型流行最廣、致病性最強，從發病動物中有較高的分離率。但不同血清型菌株之間毒力有較大差異，并非所有的血清型均具有致病性，其與動物致病性有很大關系［8］。本實驗室對豬鏈球菌分離株進行的PCR分型鑒定卻未能檢測出上述血清型。為了有利于此病的控制，仍需作進一步細致的研究。

本次藥敏試驗結果表明，豬鏈球菌分離株對β－內酰胺類抗生素如青霉素G、阿莫西林、頭孢唑啉、頭孢噻呋的敏感性較高，其中青霉素G、阿莫西林抗菌活性最高，可作為該豬場防治豬鏈球菌病的首選藥物，但是對頭孢西丁產生了明顯的耐藥性。此外，結果還發現，大部分菌株具有多重耐藥性，所有分離株對紅霉素、氧氟沙星、磺胺甲口惡唑的耐藥性尤為嚴重。其與我國其他學者在東北地區對豬鏈球菌耐藥菌株所作的耐藥性研究相符［9－10］。由此表明，本地區的豬鏈球菌對大環內酯類藥物、喹諾酮類藥物和磺胺類藥物可能產生了高耐藥性。

豬鏈球菌菌株對抗菌藥物耐藥性的產生，一方面由于抗菌藥物長期應用導致的“選擇性壓力”篩選和抗菌藥物的不合理使用加速細菌發生基因突變獲得耐藥性除外，耐藥基因在菌株中的廣泛傳播至關重要［11－12］。國外的研究表明，細菌能通過攜帶可轉移遺傳因子包括質粒、轉座子、噬菌體和整合子基因盒系統等使耐藥性擴散傳播，其中整合子潛在的基因捕獲及整合表達能力，對細菌耐藥性傳播可能是一種更為嚴重的威脅［13－15］。而這種擴散傳播可能發生在土壤內，也可能是發生在人類或動物腸道內。1959年醫務人員已開始認識到在志賀氏菌中發現的耐藥基因可通過質粒轉移至大腸埃希氏菌中。本試驗研究的豬鏈球菌，有人報道過其是通過轉座子Tn1545在菌間傳播的［16］。由此表明耐藥不僅存在于致病菌中，也存在于共生菌中，而且在食物、環境和動物中存在。

豬鏈球菌是革蘭陽性菌，從理論上講，其抵抗力不強，在治療上，很多藥物對其都有療效，但近年來由于抗生素的濫用，如在動物飼料中長期添加抗生素用于促進生長及預防和治療疾病，發生疾病后未經獸醫診斷就盲目使用大量多種抗菌藥物等，在抗菌藥物的選擇壓力下，豬鏈球菌產生了大量耐藥菌株。因此，建議豬場在防治豬鏈球菌病時，最好先做藥敏試驗篩選敏感藥物，選用兩種或兩種以上的敏感藥物交替使用。其不僅可以防止抗藥菌株的產生，指導臨床用藥，而且對于預防豬鏈球菌繼發感染，有效降低這些疾病造成的損失同樣具有重要指導意義。

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