規(guī)模化奶牛場布魯菌病的血清學(xué)調(diào)查

王雙山，王 真，呂艷麗，吳清民

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀 100193；2.安陽工學(xué)院生物與食品學(xué)院，河南 安陽 455000）

布魯菌病（簡稱“布病”）是人和牛、羊、豬等動物共患的傳染病，也是國家法定檢疫－撲殺被感染家畜的3大疫病（口蹄疫、布魯菌病和結(jié)核病）之一［1］。主要通過消化道、呼吸道、生殖道傳播，也可通過損傷的皮膚、黏膜等感染，造成以生殖系統(tǒng)為主的多器官損傷。奶牛感染后，懷孕母牛多數(shù)發(fā)生流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎，流產(chǎn)后常發(fā)生子宮內(nèi)膜炎、不孕和產(chǎn)奶量減少等。近幾年在我國奶牛優(yōu)勢區(qū)域布魯菌病疫情上升尤為突出，在各種奶牛傳染病中，布魯菌病是危害最嚴(yán)重的傳染病之一。

為掌握布魯菌病在奶牛優(yōu)勢區(qū)域規(guī)模化奶牛場感染情況，為布魯菌病防控對策提出科學(xué)的參考依據(jù)，本試驗用虎紅平板凝集試驗、96孔微量凝集試驗對兩個省不同地區(qū)幾個規(guī)模化奶牛場進行了布魯菌病感染的血清學(xué)調(diào)查。

1 材料與方法

1.1 試劑 虎紅平板凝集試驗抗原、試管凝集試驗抗原、陽性血清和陰性血清，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，按說明書使用。生理鹽水、0.5%石碳酸生理鹽水等均由本實驗室制備。

1.2 器材 玻璃板、96孔微量板，移液器、離心機、試管、牙簽、試管架、恒溫箱、冰箱等。

1.3 奶牛血樣的采集 2010年4～11月，對未接種布魯菌病疫苗的規(guī)模化奶牛場采集樣品2 591份。

1.4 待檢血清的準(zhǔn)備 從每頭奶牛尾靜脈或頸靜脈采集2～4 m L血液，室溫靜止，待血清析出，血清析出不好的，5 000 r／min離心5 min后，再取血清置于滅菌的小試管內(nèi)，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 虎紅平板凝集試驗 按GB／T18646-2002方法對被檢測奶牛做初篩試驗。

1.5.1 具體操作 潔凈的玻璃板，其上劃分成4 cm2的方格。將玻璃板上各標(biāo)記的受檢血清號，然后加相應(yīng)血清0.03 m L。在受檢血清旁滴加抗原0.03 m L。用牙簽類小棒攪動血清和抗原使之混合。每次試驗應(yīng)設(shè)陰、陽性血清對照。

1.5.2 結(jié)果判定 在陰、陽性血清對照成立的條件下，方可對被檢血清進行判定。受檢血清在4 min內(nèi)出現(xiàn)肉眼可見凝集現(xiàn)象者判為陽性（＋），無凝集現(xiàn)象，呈均勻粉紅色者判為陰性（－）。

1.6 96孔微量凝集試驗 對虎紅平板凝集試驗陽性牛再進行微量凝集試驗復(fù)檢。

1.6.1 操作方法 受檢血清的稀釋：在96孔微量板上2～6孔用移液器加入0.5%石碳酸生理鹽水稀釋液50μL，第1孔不加稀釋液。取1支小試管標(biāo)記牛編號后，加入230μL 0.5%石碳酸生理鹽水稀釋液，然后用移液器吸取被檢血清20μL加入稀釋液內(nèi)，并混合均勻。充分混勻后，用移液器在96孔微量板的第1、2孔各加入混合液50μL。第2孔再用移液器將混合液與孔內(nèi)的稀釋液混合均勻。混合方法是用移液器將混合液吸入移液器內(nèi)，在孔內(nèi)反復(fù)吹打3～4次，混合均勻后，吸取第2孔混合液50μL至第3孔，更換槍頭用移液器如前述方法進行第3孔混合。按前述方法將50μL混合液加入第4孔，如此倍比稀釋至第6孔，第6孔用移液器吸取混勻液50μL棄去。稀釋完畢，從第1孔至第6孔的血清稀釋度分別為1∶1.25、1∶25、1∶50、1∶100、1∶200、1∶400。抗原用0.5%石碳酸生理鹽水20倍稀釋，將20倍稀釋的抗原加入已稀釋好的各血清孔中，被檢血清的最終稀釋度則依次為1∶25、1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800。每次試驗均都設(shè)陽性血清、陰性血清和抗原對照。即陰性血清對照：陰性血清的稀釋和加抗原的方法與受檢血清同；陽性血清對照：陽性血清須稀釋到原有滴度，加抗原的方法與受檢血清同。第7孔抗原對照：1∶20稀釋抗原液50μL，再加0.5μL稀釋液，觀察抗原是否有自凝現(xiàn)象。在96孔微量板上貼上薄膜，在微型振蕩器上搖勻，置37℃溫箱24 h，取出檢查并記錄結(jié)果。

1.6.2 結(jié)果判定 將反應(yīng)板傾斜成45°角，沉于管底的抗原沿著傾斜面向下呈線狀流動者沉淀，表明抗原未被或不完全被血清凝集；如果孔底的抗原鋪平孔底，凝成均勻薄層，傾斜后抗原不流動，說明抗原被血清抗體所凝集。能使50%抗原凝集的血清的最高稀釋倍數(shù)，稱為該血清凝集效價。

表1 布魯菌病抗體測定操作術(shù)式 （μL）

＋＋＋＋：全部抗原凝集，凝集的抗原鋪滿管底，無抗原沉積。或雖有抗原沉淀，但反應(yīng)板傾斜成45°角，沉于管底的抗原不沿著傾斜面向下呈線狀流動。

＋＋＋：大部分抗原凝集，在管底鋪成薄膜狀，但尚有少數(shù)抗原不凝，在管底中心形成小點。

＋＋：約有半數(shù)抗原凝集，在管底鋪成薄膜，面積較小，不凝集的抗原在管底中心聚成小圓點。

＋：只有少數(shù)抗原凝集，不凝集的抗原在管底中心聚成小圓盤狀，凝集的抗原在此小圓盤周圍。

－：不凝集，抗原沉于管底，成一圓盤，將反應(yīng)板傾斜成45°角，沉于管底的抗原沿著傾斜面向下呈線狀流動的沉淀。

被檢血清1∶100稀釋，出現(xiàn)“＋＋”以上凝集現(xiàn)象時，判定為陽性。被檢血清1∶50稀釋，出現(xiàn)“＋＋”以上凝集現(xiàn)象時，判定為可疑反應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 虎紅平板凝集試驗結(jié)果 用虎紅平板凝集對A省4個地區(qū)及B省兩個地區(qū)未免疫布魯菌病的6個奶牛場2 591份血清進行布魯菌病抗體檢測，結(jié)果顯示，6個地區(qū)的6個規(guī)模牛場均受布魯菌感染，血清陽性共722份，布魯菌病抗體陽性率在14.1%～46.2%之間，平均陽性率27.9%（表2）。

表2 虎紅平板凝集試驗結(jié)果

2.2 96孔微量凝集試驗復(fù)檢結(jié)果 根據(jù)動物布魯菌病診斷技術(shù) GB／T18646-2002部頒標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，虎紅平板凝集試驗適用于家畜布魯菌病初篩試驗，試管凝集試驗適用于診斷牛種布魯菌病感染的家畜。對虎紅平板凝集試驗的檢測出的722份陽性血清，進行了微量凝集試驗。結(jié)果顯示，602份血清呈陽性，虎紅平板凝集試驗與96孔微量凝集試驗陽性符合率在80.7%～84.9%之間，平均符合率為83.4%；布魯菌病抗體陽性率在11.5%～39.3%之間，平均陽性率23.2%（表3）。

表3 平板凝集試驗的陽性血清進行試管凝集試驗

3 討論

3.1 流行趨勢 本次對兩省6個地區(qū)部分規(guī)模化奶牛場布魯菌病血清學(xué)調(diào)查表明，調(diào)查的6個奶牛場血清學(xué)反應(yīng)全部陽性，說明布魯菌病在我國奶牛場普遍存在，且感染率高，平均23.2%，個別牛場高達39.3%。本次調(diào)查的這些牛場多數(shù)是2008年以后建場的，僅僅幾年的時間，達到了很高的感染率，顯示布魯菌病在場內(nèi)蔓延之快。其原因：（1）奶牛場對布魯菌病造成的危害認(rèn)識不足，對防治布魯菌病的知識和流行狀況了解甚少。在跨地區(qū)購進奶牛優(yōu)良品種時不進行檢疫和不采取隔離措施，致使購入患有布魯菌病的奶牛，造成布魯菌病的流行。（2）布魯菌病陽性奶牛流產(chǎn)的胎兒、胎衣、羊水是病原菌通過環(huán)境感染健康奶牛的重要感染源。母牛流產(chǎn)后未及時發(fā)現(xiàn)或發(fā)現(xiàn)未能及時清理和消毒，以至于病原菌污染環(huán)境導(dǎo)致健康奶牛接觸而感染。（3）規(guī)模化奶牛場，產(chǎn)房每天都有母牛產(chǎn)犢，布魯菌病陽性母牛正常分娩時也排出大量病原菌污染產(chǎn)房，造成產(chǎn)房健康奶牛感染。

3.2 公共衛(wèi)生 布魯菌病是目前世界上流行最廣，危害最大的人獸共患病之一。人通過接觸感染動物的分泌物、體液、尸體或食入污染的肉、奶被感染。人類感染布魯菌病后，常因誤診而轉(zhuǎn)為慢性，導(dǎo)致反復(fù)發(fā)作長期不愈，影響身體健康。臨床表現(xiàn)為發(fā)燒、多汗、游走性關(guān)節(jié)痛、全身乏力等［2］。人及動物發(fā)現(xiàn)該病后，除了按照有關(guān)法規(guī)立即上報當(dāng)?shù)匦l(wèi)生及獸醫(yī)部門外，對待奶牛場配種員、獸醫(yī)及飼養(yǎng)人員等屬高危人群，為減少人感染布魯菌的風(fēng)險，應(yīng)對相關(guān)人員進行崗前培訓(xùn)，搞好個人防護工作，定期進行體檢。

3.3 關(guān)于微量凝集的操作方法 自Wright建立試管凝集試驗以來，布魯菌病試管凝集試驗一直是各國用作診斷人和動物布魯菌病的常規(guī)血清學(xué)診斷方法，我國將其列為動物布魯菌病診斷的法定正式試驗，應(yīng)用廣泛。但是《動物布魯氏菌病診斷技術(shù)》（GB／T18646-2002）規(guī)定的方法是根據(jù)當(dāng)時的實驗室儀器設(shè)備條件所建立的，隨著實驗儀器設(shè)備的不斷發(fā)展與更新，布魯菌病試管凝集試驗中以前使用的吸管現(xiàn)在已被操作更為方便準(zhǔn)確的微量移液器所取代［3］。使用移液器進行操作，可進行多份樣品同時操作、節(jié)省時間，大大提高了檢測和診斷效率，更適合大批量奶牛的布魯菌病檢驗。同時節(jié)省了抗原、稀釋液與血清的用量，有廣泛的應(yīng)用前景。

［1］吳清民.動物布魯氏菌病防控技術(shù)研究對策［J］.獸醫(yī)導(dǎo)刊，2010（3）：21-23.

［2］王傳清，李星.布魯氏菌病的流行和研究現(xiàn)狀及防控策略［J］.中國動物檢疫，2009（6）：63-65.

［3］李璐.動物布魯氏菌病試管凝集試驗方法改進的探討［J］.畜牧獸醫(yī)科技信息，2011（2）：35.