丹參多酚酸B對動脈粥樣硬化大鼠OX40／OX40L免疫通路研究

陳昕琳 章怡祎 顧仁樾 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院 （上海 200032）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是心腦血管病的主要病理基礎(chǔ)。目前關(guān)于AS的病因較一致的看法是，由損傷、炎癥、免疫功能障礙三者相結(jié)合作用的結(jié)果。近年來，OX40／OX40L作為一種新的免疫炎癥系統(tǒng)，與動脈粥樣硬化的關(guān)系開始受到越來越多的關(guān)注。關(guān)于AS的中醫(yī)病機(jī)，結(jié)合AS炎癥學(xué)說所提及的各種病因及介質(zhì)，我們認(rèn)為與中醫(yī)毒邪致病論的病因病機(jī)一致：毒邪致病，因毒而成痰成瘀，毒、痰、瘀三者相互促生，形成惡性循環(huán)，以毒為引發(fā)關(guān)鍵，以痰、瘀為有形之病灶。本研究以丹參多酚酸B（SalB）為研究對象，探討其“活血解毒－抑制免疫炎癥反應(yīng)－抗動脈粥樣硬化”的可能機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料 1.1 材料 1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 八周齡雄性SD大鼠60只，平均體質(zhì)量300g左右，由上海西普爾－必凱實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司提供（SCXK（滬）20080016）。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 丹參多酚酸B：由中國科學(xué)院提供，分子式C36H28MgO16。辛伐他?。ㄊ娼抵汉贾菽硸|制藥有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號H19990366，20mg／片。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 冷凍臺式離心機(jī)、增力電動攪拌勻漿機(jī)、FA2004N型電子天平、石英比色皿及紫外可見分光光度計(jì)（752s型）、Elx50型自動洗板機(jī)、超低溫冰箱等。

2 方法 2.1 模型的建立和分組 八周齡雄性SD大鼠，60只，隨機(jī)分成6組（正常組、模型組、西藥對照組辛伐他汀、丹參多酚酸B低劑量組、中劑量組、高劑量組），適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。正常組普通飼料喂養(yǎng)，其余大鼠予高脂飼料（82.3%大鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料、2%膽固醇、0.5%膽酸鈉、10%豬油、0.2%丙基硫氧嘧啶、5%白砂糖）喂養(yǎng)一月。于藥物干預(yù)開始前按70萬IU／kg的總劑量連續(xù)3d腹腔注射Vit D3，然后按人與大鼠等效臨床推薦劑量給予相應(yīng)藥物灌胃。4周后，各組隨機(jī)處死2只大鼠，觀察血管動脈粥樣硬化情況。繼續(xù)喂養(yǎng)剩余大鼠，至6周后全部處死取材。用藥6周后全部處死取材。

2.2 主動脈OX40／0X40L基因表達(dá)（RTPCR法）

應(yīng)用Trizol提取液常規(guī)提取細(xì)胞的總RNA，分光光度計(jì)測定A260／A280。RTPCR采用Primer3在線軟件設(shè)計(jì)引物，內(nèi)參基因以GAPDH為參照，各基因引物和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度如表1所示。采用生物電泳圖像分析系統(tǒng)計(jì)算各基因電泳條帶的光密度值，基因相對表達(dá)量＝目的基因mRNA光密度值／內(nèi)參基因mRNA光密度值。

表1 RTPCR檢測基因引物序列及產(chǎn)物長度

2.3 主動脈OX40／OX40L蛋白測定（Western Blot法）取適量主動脈組織（20mg左右），做好蛋白質(zhì)樣品的制備，采取S聚丙烯酸胺凝膠電泳（SDSPAGE）將蛋白免疫印跡采用TANON2008凝膠成像系統(tǒng)分析條帶光密度值。OX40、OX40L的表達(dá)水平以O(shè)X40、OX40L的光密度值與內(nèi)參GAPDH光密度值的相對比值表示。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，結(jié)果采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料的方差分析方法（OneWay ANOVA）進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)均以Mean±SD表示。所有檢驗(yàn)均以P＜0.05作為顯著性檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié) 果 各組大鼠主動脈OX40mRNA表達(dá)水平表2。圖1－圖3，各組大鼠主動脈OX40L蛋白水平檢測見表3。圖4－圖6。

圖1 GAPDH內(nèi)參

圖2 OX40基因

圖3 OX40L基因

圖4 各組主動脈GAPDH蛋白表達(dá)圖

圖5 各組主動脈OX40蛋白表達(dá)圖

圖6 各組主動脈OX40L蛋白表達(dá)圖

表2 各組大鼠主動脈OX40／OX40LmRNA相對表達(dá)含量變化表

表3 各組大鼠主動脈OX40、OX40L蛋白相對表達(dá)含量變化表

4 討 論 選擇OX40與OX40L作為研究的原因包括：①它存在于內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上，這些細(xì)胞被認(rèn)為是和動脈粥樣硬化形成密切相關(guān)的細(xì)胞。②它調(diào)控淋巴細(xì)胞的增殖和存活。丹參多酚酸B在抑制炎癥免疫反應(yīng)方面又有什么作用呢？是否對OX40／OX40L有所影響呢，這就是我們該部分研究等主要內(nèi)容。

4.1 OX40／OX40L與動脈粥樣硬化 人OX40又稱CD134，其基因位于染色體1P36，與腫瘤壞死因子（TNF）超家族的其他協(xié)同刺激分子如CD30、41BB等位于同一個基因簇內(nèi)［1，2］。0X40定位于活化的CD4＋和CD＋8T淋巴細(xì)胞表面，主要是CD4＋T細(xì)胞。參與T細(xì)胞的活化、增殖和遷移。人的OX40cDNA與大鼠、小鼠的同源性分別為65%和68%［3］。

OX40／0X40L通過3個階段參與免疫應(yīng)答：①在淋巴結(jié)，OX40／OX40L相互作用而活化的CD4＋T細(xì)胞移行到B濾泡區(qū)，促進(jìn)生發(fā)中心形成和抗體分泌；②OX40／0X40L信號促使CD4＋T細(xì)胞等炎癥細(xì)胞進(jìn)入血流中，再移行到炎性反應(yīng)部位；③組織來源的0X40L＋APC在局部組織結(jié)導(dǎo)CD4＋T細(xì)胞性的炎性反應(yīng)［4］。

目前許多研究中，OX40／OX40L與動脈粥樣硬化的關(guān)系開始受到重視，這與OX40／OX40L的基因位點(diǎn)以及其生物學(xué)特性和功能，還有他們在免疫應(yīng)答以及炎癥反應(yīng)中的作用是分不開的。OX40與OX40L結(jié)合后，通過抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)DC的分化成熟，增強(qiáng)T細(xì)胞的功能。對于促進(jìn)活化后CD4＋T細(xì)胞的存活、增殖和記憶性T細(xì)胞的產(chǎn)生發(fā)揮極為重要的作用［1］。研究還發(fā)現(xiàn)炎癥期的T細(xì)胞能激活OX40／OX40L信號，促進(jìn)T細(xì)胞的產(chǎn)生，并且分泌細(xì)胞因子如IL2、IL12、TNFa等。

從本研究利用RTPCR方法，檢測大鼠主動脈OX40／OX40L基因表達(dá)的結(jié)果來看，我們發(fā)現(xiàn)模型組的OX40基因表達(dá)明顯高于正常大鼠，同樣模型組OX40L基因表達(dá)也明顯上調(diào)。我們利用Western Blot法，檢測大鼠主動脈OX40／OX40L蛋白表達(dá)結(jié)果來看，模型組OX40蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，高于正常組。通過對OX40及OX40配體基因和蛋白表達(dá)的研究，我們可以發(fā)現(xiàn)動脈粥樣硬化與免疫炎癥通路OX40／OX40L的相關(guān)性。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與國內(nèi)外的研究結(jié)果一致［5，6］。動脈粥樣硬化的過程是一種慢性炎癥過程，OX40／OX40L作為一種炎癥指標(biāo)，幾乎出現(xiàn)于所有參與動脈粥樣硬化的細(xì)胞中（內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及平滑肌細(xì)胞），通過干預(yù)OX40／OX40L途徑很可能成為防治冠心病的一種新途徑。

4.2 丹參多酚酸B對OX40／OX40L途徑的干預(yù)作用

目前，通過干預(yù)OX40／OX40L途徑防止動脈粥樣硬化的研究還非常少。我們利用丹參多酚酸B對動脈粥樣硬化大鼠模型的治療過程中發(fā)現(xiàn)了，丹參多酚酸B低劑量組和中劑量組以及辛伐他汀組的OX40基因表達(dá)明顯低于模型組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時，丹參多酚酸B中劑量組和辛伐他汀組的OX40L的基因表達(dá)也明顯低于模型組。從對OX40／OX40L基因和蛋白的表達(dá)結(jié)果分析，我們認(rèn)為丹參多酚酸B和辛伐他汀對于抑制OX40／OX40L的基因表達(dá)確實(shí)有效，通過阻斷該免疫通路可以達(dá)到抑制動脈粥樣硬化的進(jìn)程。

通過研究我們發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，丹參多酚酸B各劑量組、辛伐他汀組TNFα含量明顯下降［7］，說明兩藥都具有明顯的抑制TNFα分泌的作用。而正如前所述，炎癥激活OX40／OX40L信號通路，分泌TNFα等炎性細(xì)胞因子。因此，我們可以推斷丹參多酚酸B可以通過下調(diào)OX40／OX40L的表達(dá)，從而抑制TNFα分泌，從而實(shí)現(xiàn)抑制動脈粥樣硬化炎癥反應(yīng)的目的，實(shí)現(xiàn)減緩動脈粥樣硬化進(jìn)程，最終實(shí)現(xiàn)對心臟等靶器官的保護(hù)作用。

4.3 丹參多酚酸B具有“活血解毒－抑制免疫炎癥反應(yīng)”的作用 動脈粥樣硬化的傳統(tǒng)防治方法大部分依循脂質(zhì)浸潤和內(nèi)皮損傷學(xué)說，針對危險因子（血脂）之長期監(jiān)控治療，歷經(jīng)數(shù)十年的臨床評估成果不盡如人意，追根究底在于對動脈粥樣硬化的發(fā)展過程和致病原因了解不深，其過程之復(fù)雜非單一學(xué)說所能全盤概括。動脈粥樣硬化血栓形成性疾病與祖國醫(yī)學(xué)“眩暈”、“頭痛”、“健忘”、“癡呆”、“中風(fēng)”、“胸痹”、“真心痛”、“厥心痛”、“痰飲”、“水腫”、“脫疽”等病癥有關(guān)。關(guān)于AS形成的痰瘀毒的中醫(yī)病因病機(jī)則更顯全面。AS病變部位主要在血脈。痰濁留滯血脈之中，由痰致瘀是AS的重要病理因素之一。另一方面，血脈中之瘀亦可致痰，同樣引發(fā)本病。如《諸病源候論·諸痰候》中說：“諸痰者，此由血脈奎塞，飲水積聚而不消散，故成痰也?！边@種病理狀態(tài)持續(xù)發(fā)展下去，痰借血體，血借痰凝，凝血為瘀，痰瘀互結(jié)，著于血脈，血脈上凝著之痰瘀結(jié)塊使脈管本身受損，局部氣血的運(yùn)行和溫煦受阻，日久膠結(jié)不解，凝之愈堅(jiān)，這種痰濁瘀血相凝之結(jié)塊即是AS斑塊。即《丹溪心法》所說“痰挾瘀血，遂成窠囊”。痰飲、瘀血作為津液代謝的病理產(chǎn)物，其本身皆能化毒為害，形成痰毒、瘀毒。痰瘀相關(guān)，毒、痰、瘀、三者相互促生，形成惡性循環(huán)。以毒為引發(fā)關(guān)鍵，以痰、瘀為有形之病灶，正與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)因炎癥而致AS灶相合。

［1］Sugamura K，Ishil N，E、Weinberg AD.Therapeutic targeting if the effector Tcell costimulatory molecule OX40［J］.Nat Rev Immunol，2004，4（6）：420－431.

［2］Croft M.Costimulatory members of the TNFR family：key to effective Tcell immunity ［J］.Nat Rev Immunol，2003，3（8）：609－620.

［3］孫建軍.OX40／OX40L的生物學(xué)特性和功能［J］.上海免疫學(xué)雜志，2003，2（23）：136－138.

［4］Lane P.Role of OX40singanls in coordingating CD4 T cell xelection，mingration，and cytokine differentiation in T helper（Th）1and Th2cells［J］.Exp Med，2000，191（2）：201－206.

［5］儲以薇.OX40和OX40L在免疫應(yīng)答中的熱點(diǎn)和其應(yīng)用［J］.上海免疫學(xué)雜志，2002，6（22）：428－430.

［6］Wang x，Ria M，Kelmenson PM，et al.Positional identification of TNFSF4.Encoding ox40ligand.as a gene the influences atherosclerosis susceptibility［J］.Nat Gene，2005，37（4）：365－372.

［7］陳昕琳，顧仁樾，章怡祎.丹參多酚酸B對動脈粥樣硬化大鼠炎癥細(xì)胞因子的影響［J］.上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2011，25（1）：63－67.