替米沙坦對高血壓大鼠血管ACE2表達及氧化應激水平的影響

金海燕，鐘久昌，2，宋 蓓，2，葉佳穎，張麗紅，李宇琳，2，于 茜，徐旭東，林國珍

(1.上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院臨床心理科與醫學基因組學國家重點實驗室，上海 200025;2.上海市高血壓研究所，上海市血管生物學重點實驗室，上海 200025;3.寧波大學醫學院分子高血壓研究室，浙江寧波 315211;4.復旦大學上海醫學院解剖與組織胚胎學系上海 200032)

高血壓病是危害人類健康的最常見的慢性病，也是心腦血管病最主要的危險因素［1－2］。血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)及其新近發現的催化酶血管緊張素轉換酶2(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)是機體內血管一氧化氮(nitric oxide，NO)生成與氧化應激狀態的關鍵調控因子，在高血壓病的發生、發展過程中起著重要的作用［3－6］。替米沙坦(telmisartan)為一種新型長效的AngⅡ1型受體(AT1)的拮抗劑(ARB)，已廣泛應用于臨床治療高血壓患者［1，7－8］，但其是否通過調控血管 ACE2表達進而在血管氧化應激調控中發揮作用目前尚未見報道。本研究旨在探討替米沙坦(telmisartan)對自發性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rat，SHR)血管ACE2表達的影響及其參與血管保護功效可能的機制。

1 材料與方法

1.1 動物由上海斯萊克實驗動物有限責任公司［許可證號 SCXK(滬)2007-0005］提供SHR大鼠24只及同源對照WKY(Wistar-Kyoto rats，WKY)大鼠8只。將大鼠隨機分成4組，每組8只:WKY對照組(WKY-C);SHR對照組(SHR-C);低劑量替米沙坦治療組(SHR-L);高劑量替米沙坦治療組(SHRH)。大鼠均為♂，9～10周齡，體質量(250±30)g。大鼠適應性飼養1周。替米沙坦由德國Boehringer Ingelheim公司提供，溶解于無菌生理鹽水中，配制濃度為1 g·L－1。大鼠每日灌胃給藥(telmisartan 5或10 mg·kg－1或安慰劑生理鹽水 5 mg·kg－1)，為期10周。實驗結束后，麻醉處死大鼠，分離胸主動脈迅速置于液氮，后轉入－80℃待測。

1.2 Western blot用Bradford法測定大鼠主動脈組織總蛋白濃度。采用常規的Western blot法檢測大鼠主動脈組織中ACE2蛋白與eNOS磷酸化水平。取40 μg總蛋白進樣于預灌制的8～10%聚丙烯酰胺凝膠中，100伏電泳2 h，然后電轉移至PVDF膜。用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，將膜采用抗ACE2、eNOS一抗及抗磷酸化p-eNOS(Ser1177)一抗(美國Santa Cruz及Cell Signaling公司)孵育過夜。洗膜后接著室溫下將膜用二抗孵育1 h 30 min，洗膜3次，每次10 min。最后采用ECL試劑盒顯影曝光，對特異性條帶進行半定量分析，同時采用α-tubulin蛋白作為內對照。

1.3 NO含量測定采用硝酸還原酶比色法檢測主動脈組織中硝酸鹽(NO3－)和亞硝酸鹽(NO2－)含量來間接反映各種條件刺激下大鼠主動脈組織中NO水平。NO檢測試劑盒購自南京建成生物有限公司，嚴格按說明書進行操作。采用Beckman可見光－紫外分光光度儀，在550 nm條件下，0.5 cm光徑比色測各管吸光度值，根據標準曲線計算NO含量。同時設立空白對照和陽性對照組，每個樣品檢測3次，取其平均值。

1.4 丙二醛(MDA)含量測定采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法測定大鼠主動脈組織MDA含量，其原理是過氧化脂質產物中的MDA可與TBA縮合，形成紅色產物，在532 nm處有最大吸收峰。MDA檢測試劑盒購自南京建成生物有限公司，采用分光光度計測定收集主動脈組織上清MDA含量，嚴格按說明書進行操作。

1.5 統計學處理資料數據以±s表示，采用SPSS(16.0)軟件進行分析處理。多個樣本均數的比較采用單因素方差分析;多個樣本均數的兩兩比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 替米沙坦對SHR大鼠血管ACE2蛋白表達的影響如Fig 1所示，與WKY大鼠相比，SHR大鼠主動脈組織中ACE2蛋白水平明顯降低(0.39±0.05 vs 1.00±0.06，P＜0.01)。與SHR對照組相比，替米沙坦低、高劑量治療組SHR大鼠主動脈組織中 ACE2蛋白表達均明顯上升(0.62±0.06，0.65±0.07 vs 0.39±0.05，P 值均 ＜0.05)。

2.2 替米沙坦對SHR大鼠血管eNOS磷酸化表達及NO水平的影響與WKY對照組相比，SHR大鼠主動脈組織中Ser1177-eNOS磷酸化水平明顯降低，伴NO水平下調(p-eNOS:0.43±0.06 vs 1.00±0.04;NO mmol·g－1protein:11.5 ± 2.1 vs 27.8 ±4.9;P值均＜0.01，Fig 2、3)。而經替米沙坦治療后，SHR大鼠(SHR-L與SHR-H組)主動脈Ser1177-eNOS磷酸化表達和NO水平則明顯增加(p-eNOS:0.68 ±0.07，0.71 ±0.06 vs 0.43 ±0.06;NO mmol·g－1protein:19.2 ±3.3，23.9 ±3.2 vs 11.5 ±2.1;P值均 ＜0.05，Fig 2、3)。

Fig 1 ACE2 protein expression in aortas of WKY rats and SHR

Fig 2 Effects of Telmisartan on Ser1177-eNOS phosphorylation level in rat aortas

2.3 替米沙坦治療后SHR大鼠血管MDA含量的改變如Fig 4所示，與WKY對照組相比，SHR大鼠主動脈組織 MDA含量上升(393.9±17.9 vs 186.3 ±14.5 nmol·g－1protein;P ＜0.01)。而經低、高劑量替米沙坦治療后，SHR主動脈組織MDA含量則明顯降低(271.9±16.1，249.2±19.6 vs 393.9±17.9 nmol·g－1protein;P 值均 ＜0.05)。

3 討論

Fig 3 Effects of Telmisartan on NO level in rat aortas(mmol·g－1Pro)

Fig 4 Effects of Telmisartan on MDA contents in rat aortas(nmol·g－1Pro)

活性氧族(reactiveoxygenspecies，ROS)增加及氧化應激增強參與高血壓病的發生、發展，最終導致高血壓內皮功能紊亂和心血管等靶器官損害［3－4，9］。在腎素血管緊張素系統(renin-angiotensin system，RAS)中，AngⅡ是心血管系統中ROS生成和氧化應激的重要激活物［3，5－6，9－11］。ROS 參與多種細胞內信號轉導途徑，引發血管炎癥反應、細胞增殖及血管重塑等過程，最終導致高血壓病的發病［2，5－6，9］。NO主要由內皮來源的NO合酶eNOS催化L-精氨酸代謝生成，具有擴張血管、抗炎癥、抑制細胞凋亡等作用，對心血管系統具有保護作用。機體內心血管組織ROS的過度生成會降低NO的生物活性，削弱心血管組織的抗氧化能力，從而導致心血管組織損害［9－11］。有趣的是，本研究發現，與 WKY 對照大鼠相比，SHR大鼠血管組織中出現eNOS磷酸化水平下降，同時伴血管NO水平下調及MDA水平增加。MDA是細胞膜氧自由基連鎖反應的終產物之一，其含量直接反映細胞脂質過氧化的速率和強度，代表細胞的氧化應激水平。上述提示高血壓大鼠主動脈組織中eNOS/NO體系下調可能導致抗氧化能力下調，通過促進MDA生成增加，導致高血壓大鼠血管組織氧化應激增強。

ACE2表達或活性異常可能參與高血壓病的發生、發展過程，通過調節ACE2的轉錄與表達為防治高血壓病及其并發癥的重要手段［1，6，10］。在新的RAS中，ACE2可高效降解 ACE的作用產物 AngⅡ，使之生成Ang-(1-7);還可競爭性地作用于ACE的底物AngⅠ，使之生成Ang-(1-9)，后者經ACE作用進一步生成為Ang-(1-7)。Ang-(1-7)為一種較強的舒血管物質肽，主要分布于心臟、血管、腎臟等處和血液中，通過結合Mas受體促進緩激肽、前列腺素和NO的釋放，發揮其擴血管、抗氧化及促凋亡等功效［1，4，9－11］。ACE2 基因通過拮抗 AngⅡ的作用減少ROS生成，從而發揮一定的抗氧化功效。新近研究顯示，ACE2的過表達能改善小鼠NOS活性且增加NO信號，從而降低機體氧化應激水平，而ACE2基因敲除小鼠出現機體內氧化應激水平增加，造成各組織氧化損傷［6，9］。本研究發現，與WKY對照大鼠相比，SHR大鼠血管組織中出現ACE2蛋白水平降低，同時伴有eNOS/NO體系下調及MDA 增加。Zhong等［5－6］新近研究證實，Ang Ⅱ可以導致小鼠心臟組織ACE2表達下調，而ACE2基因缺失或表達減少可導致心臟和腎臟組織細胞內NADPH氧化酶的活性增加，同時伴有白介素(IL)-1、IL-6、腫瘤壞死因子等炎癥介質增加，從而加重AngⅡ介導的心血管及腎臟組織氧化損傷。替米沙坦能通過選擇性地、不可逆地阻斷AngⅡ與其1型受體AT1結合，減少AT1受體所介導AngⅡ引起心血管的肥大、細胞增殖和血管氧化應激生成，另外還可能反饋性增加AngⅡ與AT2受體的結合，進而抑制心血管增殖及氧化應激損傷，發揮其心血管保護作用［2，7－8，12］。另外，替米沙坦具有特異性的苯丙咪唑環和異芳香基團，具備脂溶性強和組織穿透性高的特性，與AT1受體的親合力更高，從而對AngⅡ的拮抗作用更強、更持久［2，8，12］。本研究結果顯示，長期替米沙坦治療后，SHR大鼠血管組織中出現ACE2蛋白和eNOS磷酸化水平增加，同時伴血管NO生成增加及MDA水平降低，提示替米沙坦通過調節血管ACE2基因表達及改善eNOS/NO信號，對逆轉高血壓大鼠血管組織氧化應激損傷中起到一定的作用，從而實現其在高血壓治療中的血管保護功效，但其相關機制有待于深入探討。ACE2的發現拓展了RAS體系，為深入研究高血壓的氧化應激機制及尋求更加符合生理的改善氧化應激治療策略提供了機遇。通過各種途徑干預ACE2表達及活性，可望成為高血壓病等氧化應激性疾病防治的新途徑。

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