健脾復方對人大腸癌移植瘤裸小鼠腫瘤細胞凋亡的影響

劉 靜,朱 琰,史 勤,呂 祥,馮彥軍

(1.上海市中醫醫院腫瘤科,上海,200071;2.上海中醫藥大學附屬曙光醫院藥劑科,上海,200021)

我國大腸癌發病率和病死率在惡性腫瘤中占第5位[1],而在上海等大城市已成為繼肺癌之后的第二位高發腫瘤。由于各種原因,我國大腸癌的患者以進展期居多,而目前進展期大腸癌術后仍有近50%的患者發生復發或轉移,5年生存率僅為40%～50%[2]。祖國醫學中,健脾益氣法是大腸癌防治工作中重要的手段之一[3]。本研究通過觀察健脾復方對人大腸癌原位移植瘤裸小鼠腫瘤細胞凋亡的影響,來探討健脾復方對大腸癌發生發展的抑制作用,并研究其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本次研究由中科院上海實驗動物中心提供53只BALB/C裸小鼠,雌雄不限,無特定病原體(SPF)級,4～6周齡,體重18～20 g,并在上海中醫藥大學動物實驗室(許可證號:SYXK[滬]2004 -2005)進行飼養,按SPF級要求,并進行自由飲食。

1.2 造模

1.2.1 制備原位移植瘤塊:取3只BALB/C裸小鼠,對數生長期的大腸癌HT-29細胞(由上海市腫瘤研究所提供)制備成單細胞懸液,調整細胞濃度至8×107/mL,右側腋下皮下注射,劑量為0.1 mL/只,連續觀察28 d,直至皮下瘤直徑達1 cm時將裸小鼠處死,并切下瘤塊,將壞死部分去除,分理出其中淡黃色或呈魚肉狀的瘤塊,置于生理鹽水中,再剪成直徑為2 mm的小瘤塊備用。1.2.2 制作原位移植瘤模型[4]:將40只BALB/ C裸小鼠術前禁食12 h,氯胺酮腹腔內麻醉,仰臥固定,以下腹正中切口打開腹腔,用手術刀在距盲腸末端1 cm處腸系膜側的漿膜面輕輕刮傷漿膜層,再將直徑為2 mm的小瘤塊用OB膠黏附在裸小鼠腸壁上,以無損傷縫線全層縫合,檢查無活動性出血后關腹。術后所有裸小鼠暫時分籠飼養至完全清醒。整個手術過程在切除皮下瘤后1 h內完成。另10只裸鼠行假手術后作為正常對照組。

1.3 藥物制備

1.3.1 健脾復方的制備:由上海市中醫醫院制劑室協助制備。健脾復方的藥物比例為:黃芪30 g,黨參12 g,炒白術12 g,茯苓12 g,半夏9 g,天龍6 g,紅藤30 g,藤梨根30 g,生牡蠣30 g,炙甘草6 g。根據該處方比例,取生藥900 g,濃煎至300 mL,含生藥3 g/mL。

1.3.2 塞來昔布溶液制備:將塞來昔布膠囊(商品名:西樂葆,輝瑞制藥有限公司生產)磨粉,用無菌蒸餾水溶解,每mL含塞來昔布1.33 mg,由上海市中醫醫院制劑室協助制備。

1.3.3 5-氟尿嘧啶(5-Fu)注射液:由上海旭東海普制藥有限公司生產,規格為10mL∶0.25g。

1.4 分組與給藥方案

將53只BALB/C裸小鼠隨機分為5組:健脾復方組、塞來昔布組、5-Fu組、模型對照組和空白對照組,每組10只。健脾復方組予健脾復方灌胃(0.5 mL/次,1次/d)+生理鹽水腹腔注射(1 mg/次,1次/周)。塞來昔布組予塞來昔布溶液灌胃(0.5 mL/次,1次/d)+生理鹽水腹腔注射(1 mg/次,1次/周)。5-Fu組予生理鹽水灌胃(0.5 mL/次,1次/d)+5-Fu腹腔注射(1 mg/次,1次/周)。模型對照組予生理鹽水灌胃(0.5 mL/次,1次/d)+生理鹽水腹腔注射(1 mg/次,1次/周)。正常對照組予生理鹽水灌胃(0.5 mL/次,1次/d)+生理鹽水腹腔注射(1 mg/次,1次/周)。5組均于成功造模后第2天開始給藥,共8周。所有實驗動物均給予飼料餅喂養,并自由飲用消毒水。

1.5 標本處理

5組裸小鼠均于成功造模后8周處死,之后立即將腹腔打開,并將腫瘤組織取出。取小塊腫瘤組織立即-80℃液氮保存,其余組織(空白對照組取腸組織)采用10%甲醛溶液固定,并酒精梯度脫水、石蠟包埋后,切片厚度約6μm,再用蘇木精染色,最后送病理科。

1.6 指標檢測方法

免疫組化法檢測信號轉導與轉錄激活因子-3(Stat-3)、B細胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)、存活素(Survivin)、半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3、Cas2 pase-8和Caspase-9的表達,試劑由 SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY,INC提供,嚴格根據說明書進行檢測。

表1 免疫組化法檢測各組裸小鼠凋亡因子表達結果(n=10,±s,ng/L)

表1 免疫組化法檢測各組裸小鼠凋亡因子表達結果(n=10,±s,ng/L)

3采用廣義線性模型進行組間比較;采用LSD法與模型對照組比較,##P<0.01;采用LSD法與塞來昔布組比較,△P<0.05,△△P<0.01;采用LSD法與5-Fu組比較,▲P<0.05,▲▲P<0.01;采用LSD法與空白對照組比較,☆☆P<0.01

指標 健脾復方組 5-Fu組 塞來昔布組 模型對照組 空白對照組 P值3 Stat-3 0.14±0.02## 0.17±0.03 0.15±0.03## 0.23±0.03 0.14±0.07## 0.0389 Survivin 0.12±0.04△▲▲ 0.18±0.02 0.16±0.03 0.15±0.03▲ 0.10±0.03##△△▲▲ 0.0050 Bcl-2 0.11±0.03##▲▲ 0.18±0.03☆☆ 0.13±0.03▲▲☆☆ 0.15±0.03 0.09±0.02## 0.0006 Caspase-9 21.22±7.01##▲▲ 11.48±4.98 23.96±6.22##▲▲ 9.36±2.65 20.58±13.76##▲▲ 0.0012 Caspase-8 17.69±11.77## 11.41±2.61##△△ 19.27±6.85## 3.12±1.20 8.54±4.80△△ 0.0005 Caspase-3 18.60±11.45## 10.68±3.27 14.61±4.68 5.91±3.27 20.44±18.16## 0.0071

2 結 果

2.1 Stat-3的表達

5組裸小鼠腸組織的Stat-3表達見表1。經廣義線性模型檢驗,F=10.09,P=0.0389。經LSD法兩兩比較,健脾復方組、塞來昔布組和空白對照組Stat-3表達顯著低于模型對照組(P<0.01)。

2.2 Survivin的表達

5組裸小鼠腸組織的Survivin表達見表1。經廣義線性模型檢驗,F=14.86,P=0.0050。經LSD法兩兩比較,健脾復方組和空白對照組Survivin表達低于5-Fu組、塞來昔布組;空白對照組Survivin表達低于模型對照組(P<0.05或P<0.01)。

2.3 Bcl-2的表達

5組裸小鼠腸組織的Bcl-2表達見表1。經廣義線性模型檢驗,F=19.76,P=0.0006。經LSD法兩兩比較,健脾復方組、塞來昔布組和空白對照組Bcl-2表達低于模型對照組;健脾復方組、塞來昔布組Bcl-2表達低于5-Fu組;5-Fu組和塞來昔布組Bcl-2表達高于空白對照組(P<0.01)。

2.4 Caspase-9、Caspase-8和Caspase-3的表達

5組裸小鼠腸組織的Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9表達見表1。Caspase-9的表達經廣義線性模型檢驗,F=18.13,P=0.0012。經LSD法兩兩比較,健脾復方組、塞來昔布組和空白對照組Caspase-9表達高于模型對照組和5-Fu組(P<0.01)。Caspase-8的表達經廣義線性模型檢驗,F=20.00,P=0.0005。經LSD法兩兩比較,健脾復方組、塞來昔布組和5-Fu組Caspase-8表達高于模型對照組;塞來昔布組的Caspase-8表達高于5-Fu組和空白對照組(P <0.01)。Caspase-3的表達經廣義線性模型檢驗,F=14.06,P=0.0071。經LSD法兩兩比較,健脾復方組、空白對照組Caspase-3表達高于模型對照組(P<0.01)。

2.5 病理結果

健脾復方組、塞來昔布組、5-Fu組、模型對照組各裸小鼠取得的瘤塊組織均為低至中度分化腺癌,癌細胞異型性明顯,多呈實體狀排列,部分呈腺樣排列,腫瘤間質少,均有不同程度的腫瘤組織壞死和炎細胞浸潤。

3 討 論

臨床研究提示健脾復方聯合化療在大腸癌術后患者中顯示了一定的療效,不僅能夠改善患者的臨床癥狀,減少不良反應,而且能夠提高患者生存率[5-9]。細胞凋亡異常是腫瘤發生發展的主要因素,那么健脾復方是否也能通過對細胞凋亡的調控,從而影響到大腸癌的發展呢?已有報道[10]通過胃癌移植瘤裸小鼠模型,顯示健脾方藥活化Caspase-9和Casepase-3,實現體內誘導腫瘤細胞凋亡,其機制與下調Stat-3和Bcl-2的表達、抑制 P-Stat-3和Bcl-2在細胞內表達有關,但是很少有研究探討健脾中藥對大腸癌細胞凋亡的影響。

這些基因中既可能單獨調節細胞凋亡,也可相互影響,相互作用。Stat-3是轉錄信號轉導子與激活子家族的重要成員,通過激活下游癌基因,使抑癌基因失活,從而改變細胞周期進程,阻斷細胞凋亡,使腫瘤獲得不斷增殖的能力。Stat -3下游目的基因包括Bcl-2和Survivin。Sur2 vivin是處于細胞增殖與細胞死亡界面的分子,通過內源性及外源性途徑最終作用于天冬氨酸特異性蛋白酶(Caspases)家族,抑制細胞凋亡[11]。Bcl-2也可阻斷細胞色素c從線粒體釋放,從而影響Caspase家族抑制細胞凋亡。含有半胱氨酸的Caspases是近年來發現的一組存在于胞質溶膠中的結構上相關的半胱氨酸蛋白酶,現已確定至少存在11種Caspase,Caspase家族又可分為起始Caspase和執行 Caspase,其中 Caspase-8和Caspase-9參與細胞凋亡的起始;Caspase-7參與細胞凋亡的執行。在凋亡信號的作用下,細胞色素c從線粒體釋放出來,激活Caspase-9前體轉變成Caspase-9,后者再激活Caspase-3,激活的Caspases引起DNA斷裂和細胞骨架成分降解。

研究發現塞來昔布可抑制結腸癌的發生和轉移,促進細胞凋亡等作用[12],因而塞來昔布對大腸癌的治療作用也被廣泛研究。本研究也將其作為對照組之一,結果顯示塞來昔布對大腸癌細胞凋亡有一定的調控能力,與文獻報道[12]一致。

本研究結果顯示,大腸癌組織中Stat-3、 Bcl-2、Survivin和Caspase-9、Caspase-8、Cas2 pase-3的表達均異常,證實了在大腸癌中存在細胞凋亡的異常。健脾復方能下調Stat-3、Bcl-2的表達,上調Caspase-9、Caspase-8、Caspase-3的表達,最終促進細胞凋亡的發生。這些結果提示了健脾復方抑制大腸癌發展的作用途徑之一是抑制大腸癌的細胞凋亡[13-14]。健脾復方對于凋亡因子的調控也有優于其他治療組的趨勢。但本研究仍有不確定的結果,例如健脾復方對于Sur2 vivin的調節作用有待于進一步的實驗進行確定。

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