雙污泥反硝化聚磷系統污泥的培養與馴化

史 靜，呂錫武，張懷玉，楊子萱

（東南大學 能源與環境學院，南京210096）

雙污泥反硝化除磷工藝是用厭氧／缺氧環境來代替傳統的厭氧／好氧環境，馴化培養出一類以硝酸根為最終電子受體的反硝化聚磷菌（denitrifying phosphorus removing bacteria，DPB），通過反硝化除磷菌和硝化菌的代謝作用同時脫氮除磷［1］。該技術解決了傳統生物脫氮除磷工藝中碳源不足，泥齡矛盾，氮磷處理效率難以同步提高等問題［2－3］，逐漸成為污水生物處理技術領域研究的熱點。

反硝化除磷污泥和硝化污泥的成功培養和馴化是雙污泥工藝穩定運行的前提。硝化污泥是化能自養菌，其生長需要充足的溶解氧，需要保證好氧條件和一定的堿度。對于聚磷菌，主流存在2種說法：一類菌屬說［4］和兩類菌屬說［5］。一類菌屬說指系統中指存在一類聚磷菌，它們在一定程度上具有反硝化能力，關鍵在于厭氧／缺氧這種交替運行的環境條件是否得到了強化，只有給聚磷菌創造特定的厭氧／缺氧交替環境誘導出其體內具有反硝化作用的酶，才能使其具有反硝化能力［6］。兩類菌屬說是指聚磷菌可以分為兩大類，一類僅能利用氧氣作為電子受體，另一類則既能利用氧氣又能利用硝酸鹽作為電子受體。無論哪種假說，反硝化聚磷菌的生長都與好氧聚磷菌的生長以及厭氧／缺氧條件的強化密切相關。

基于上述理論，并考慮在不影響反硝化聚磷菌生長的情況下盡量抑制其主要競爭者聚糖菌和反硝化菌的生長，試驗采取低碳高磷進水、兩階段的運行方式進行反硝化聚磷污泥的培養，并在硝化污泥和反硝化聚磷污泥成功培養后采用厭氧／缺氧／硝化－序批 式 反 應 器 （anaerobic／anoxic／nitrification－sequencing batch reactor，A2N－SBR）工藝對其脫氮除磷效果進行了試驗。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗裝置

采用SBR反應器進行污泥培養，裝置均采用PVC材料制作，反硝化聚磷污泥培養池和硝化污泥培養池的容積分別為75L和120L。A2N－SBR試驗中，厭氧／缺氧SBR池 （anaerobic／anoxic－sequencing batch reactor，A2－SBR）和好氧硝化SBR池（nitrification－sequencing batch reactors，N－SBR）的有效體積均為65L。試驗中不同狀態的轉換通過時間控制器控制，采用加熱棒進行溫度控制，溫度為20～28℃。

1.2 污泥馴化方法和運行方式

反硝化聚磷接種污泥和硝化接種污泥均取自南京市某污水處理廠氧化溝。污泥馴化采用人工配水，通過投加乙酸鈉、葡萄糖、尿素、磷酸二氫鉀、碳酸氫銨、硝酸鉀和碳酸鈉改變進水水質。

反硝化聚磷污泥馴化分為2個階段，第1階段為好氧聚磷污泥的培養階段，運行方式為厭氧4.5h，好氧4.5h，沉淀2.0h，進出水1.0h，周期為12.0h。進 水 COD、TN 和 SP 分別為200、10、20～35mg·L－1。運行約40d，即80周期。好氧階段氣水比為12∶1。

第2階段為反硝化聚磷污泥的培養，運行方式為厭氧4.0h，缺氧4.5h（其中硝酸鹽進樣0.5h），好氧0.5h，沉淀2.0h，進出水1.0h，周期為12.0h。好氧階段氣水比為12∶1。厭氧階段進水量為50L，缺氧階段硝酸鹽進樣量為10L，在分析和討論中此階段的進水磷濃度、厭氧釋磷量以及其他濃度均為容積為60L的折算濃度。進水COD、TN和SP分別為120、10、20～35mg·L－1。硝酸鹽在缺氧初始采用連續投加的方式，進樣時間為0.5h，投加濃度為30～50mg·L－1，投加濃度隨周期逐漸增加。運行約60d，即120周期。

硝化污泥馴化運行方式為好氧9.0h，沉淀2.0h，進出水1.0h。好氧階段氣水比為15∶1。進水COD、氨氮和SP濃度分別為80、30～50、3mg·L－1，堿度為250～350mg·L－1。氨氮投加濃度隨周期逐漸增加。運行約100d，即200個周期。

1.3 水質指標與分析方法

水質指標采用國家環保總局頒布的標準分析方法進行測定［7］。CODcr：重鉻酸鉀法；氨氮：納氏試劑分光光度法；NO3－－N：紫外分光光度法；PO43－－P：鉬銻抗分光光度法；NO2－－N：N－（1－萘基）－乙二胺光度法。

1.4 熒光原位雜交（fluorescence in－suit hybridization，FISH）分析

1.4.1 玻片的處理 玻片用熱肥皂水刷洗，1%的HCl浸泡24h，高溫滅菌20min；用1%的HCl煮沸10min，烘干；載玻片放入APES與丙酮的1∶50溶液（現用現配）1min，然后取出用滅菌處理過的蒸餾水清洗后于室溫下干燥，置4℃下保存備用。

1.4.2 樣品的采集與預處理 用經高溫滅菌的聚乙烯管取活性污泥；加滅菌蒸餾水適量，震蕩混勻，超聲波處理使細菌分散；取清洗下來的懸濁液，按照1∶1加入4%的多聚甲醛，于4℃固定；固定樣本用PBS 10 000r／min，離心漂洗3次；加PBS與乙醇的1∶1溶液于－20℃下保存。

取10μL樣品在載玻片上涂抹24mm×24mm大小；37℃烘箱熱固定2h；依次用50%、80%、96%乙醇室溫下脫水3min；室溫下干燥。

1.4.3 雜交反應 所使用的探針包括硝化菌探針NIT3（CCTGTGCTCCATGCTCCG）和聚磷菌探針PAO651（CCCTCTGCCAAACTCCAG），上述探針5'端分別用FITC、Cy－3標記。探針濃度均為50ng／μL。硝化細菌雜交液為：40%去離子甲酰胺（DAF）、0.01%SDS、20mmol／L Tris－HCl（pH＝7.2）、0.9mol／L NaCl；PAO 雜交液為：0.9mol／L NaCl、20mmol／L Tris－HCl（pH＝7.2）、0.01%SDS、35%DAF。

密閉雜交盒底部放高壓滅菌處理過的吸水紙，用雜交液浸潤，使雜交環境保持一定濕度。每張帶有樣品的載玻片上加入24μL的雜交液和1μL探針，加蓋硅化蓋玻片，放入雜交盒內進行雜交反應。雜交溫度為46℃，硝化細菌、PAO雜交反應時間分別為5、2h。

1.4.4 洗脫 將雜交后的載玻片從雜交盒中取出，放入48℃預熱的雜交洗脫液中20min，室溫下晾干。硝化菌洗脫液：20mmol／L Tris－HCl（pH＝7.2）、0.01%SDS、5mmol／L EDTA、60mmol／L NaCl；PAO洗脫液：20mmol／L Tris－HCl（pH＝7.2）、0.01%SDS、5mmol／L EDTA、70mmol／L NaCl。

1.5 掃描電鏡觀察硝化污泥和反硝化聚磷污泥

取樣沉淀去上清液，樣品在2.5%的戊二醛中4℃固定，離心去上清液；加入0.1M，pH＝7.0的PBS緩沖溶液，分散均勻并離心漂洗3次。用濃度梯度分 別 為 30%、50%、70%、85%、95%、100% 的乙醇梯度脫水；真空干燥；用導電膠將干燥后的樣品粘在樣品臺上，放入離子濺射儀中鍍金膜；采用型號為JSM－6360LV 掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）進行觀察和拍照。

2 結果與討論

2.1 好氧聚磷菌的富集和馴化

反硝化聚磷污泥培養第1階段的主要目標是富集馴化PAOs。為了減少聚糖菌（glycogen－accumulating organisms，GAOs）對PAOs富集的影響，采用進水高磷濃度培養的方法。GAOs同樣適宜生長于厭氧／好氧交替運行的環境，其代謝過程與PAOs相似，但并不發生磷的釋放和吸收［8］。有研究表明［9－13］：在低碳磷比條件下，污泥的含磷量明顯升高，有利于聚磷菌生長，高進水碳磷比則有利于聚糖菌的生長。因此采取進水高磷濃度的方式富集PAOs同時抑制GAOs的生長。

培養第1階段從第12周期開始對進水、厭氧結束、好氧結束和出水的磷濃度進行測定。第17周期出現了污泥發黑、沉降性能差的現象，因此進行了少量排泥，并在第18～21周期減少進水COD至75～100mg·L－1，第22周期后恢復正常進水濃度。

從圖1可知，在進水高磷濃度的培養條件下，污泥在前36周期為“適應”階段。雖然有釋磷和聚磷現象，但釋磷和聚磷量較小，釋磷量、聚磷量、除磷量（除磷量＝進水磷濃度－出水磷濃度）分別為2.6～7.5、6.0～18.4、0.8～12.2mg·L－1。第36周期后出現了明顯的釋磷和聚磷現象，且釋磷和聚磷量均具有上升的趨勢（如圖2所示），最大釋磷量、聚磷量和除磷量分別為77.2、89.4、25.0mg·L－1，聚磷量與釋磷量之比基本保持在1.2～1.4，實現了強化生物除磷系統希望達到的理論值。

圖1 好氧聚磷污泥培養過程中各階段水中磷濃度隨周期的變化

圖2 好氧聚磷污泥培養過程中釋磷量、聚磷量和除磷量隨周期變化

在第1階段培養結束后對一周期的釋磷、聚磷情況進行了監測，磷變化曲線如圖3所示。進水、厭氧結束、好氧結束和沉淀結束的磷濃度分別為24.1、100.1、2.98、4.37mg·L－1。釋磷量、好氧聚磷量和除磷量分別為76、97.12、19.7mg·L－1。厭氧段初始15min釋磷速率最大，為2.55mg·L－1·min－1，初始15min的釋磷量約占總釋磷量的50.3%。分析認為：在上一周期的好氧過程中，PAOs不斷氧化分解體內儲存的聚 β 羥基丁酸酯（poly－β－hydroxybutyrate，PHB）等釋放能量并過量攝取污水中的磷，污泥處于“饑餓”狀態，且厭氧初始的有機底物濃度最大，使聚磷菌將有機物轉化為體內PHB和釋磷的驅動力最大，因此具有最大的釋磷速率。好氧聚磷階段為270～540min，在480min處基本完成聚磷，聚磷速率采用一級動力學方程。即：

圖3 好氧聚磷污泥培養末期一周期磷變化曲線

圖4 好氧聚磷過程一級反應線性擬合

2.2 反硝化聚磷菌的富集和馴化

第2階段的主要目標是富集馴化DPB。考慮到在缺氧階段需投加硝酸鹽，反硝化菌可在利用厭氧階段剩余碳源進行反硝化，與DPB競爭硝酸鹽［14－15］，此外有研究表明碳源和硝酸鹽同時存在時對反硝化除磷產生不利影響［16］，較低的C／N適合反硝化除磷，因此第2階段的培養減少進水碳源量。同時缺氧段投加硝酸鹽采取逐漸加量的方式，防止培養初期硝酸鹽在缺氧段不能完全消耗，將剩余的部分硝酸鹽帶入下一周期。

第2階段從第12周期開始對進水、厭氧結束、好氧結束和出水的磷含量進行測定，測定結果如圖5、圖6所示。第2階段釋磷量、缺氧聚磷量和除磷量為13.3～39.2、28.6～54.0、7.6～29.4mg·L－1。由于減少了進水的碳源量，與第1階段相比，這一階段釋磷量和聚磷量沒有第1階段末期大，但除磷量基本維持在20mg·L－1左右，平均為19.3mg·L－1，與第1階段末期除磷量相近。缺氧聚磷量占總聚磷量的百分比具有上升的趨勢，說明污泥利用硝酸鹽作為電子受體的反硝化聚磷能力逐漸上升。同時在測定中還發現，缺氧結束和沉淀出水中會存在亞硝酸鹽，濃度范圍分別為0.0～3.6、0.0～5.0mg·L－1。

圖5 反硝化聚磷污泥培養過程中各階段水中磷濃度隨周期的變化

圖6 反硝化聚磷污泥培養過程中缺氧聚磷量占總聚磷量百分比變化

在第2階段培養結束后對一周期的磷和硝酸鹽的變化進行了監測，變化曲線如圖7所示。進水、厭氧結束、缺氧結束、好氧結束和沉淀結束的磷濃度分別為34.2、55.9、12.6、12.3、12.6mg·L－1。釋磷量、缺氧聚磷量和除磷量分別為21.7、43.3、21.6mg·L－1，缺氧段初始30min具有最大的聚磷速率為1.19mg·L－1·min－1，是第1階段最大好氧聚磷速率的69.6%。好氧聚磷和反硝化聚磷的主要區別為：以氧氣作為電子受體消耗單位NADH2產生三分子ATP，而以硝酸鹽為電子受體消耗單位NADH2產生兩分子ATP，導致氧化單位NADH2所吸收的磷酸鹽量（P／NADH2）不同［17－19］。因此，在聚磷段初始DPB和PAOs體內PHB均充足的情況下，缺氧聚磷速率較好氧聚磷速率低。

圖7 反硝化聚磷污泥培養末期一周期氮磷變化曲線

缺氧段硝酸鹽的總投加量為50mg·L－1，消耗量為33.9mg·L－1，平均單位硝酸鹽的消耗量對應的除磷量為1.28（mg－P）·（mg－N）－1。出水的磷、硝氮濃度分別為12.6、16.9mg·L－1，但沒有繼續發生缺氧反硝化，同時好氧階段也沒有明顯的聚磷現象，分析認為這時DPB胞內的PHB成為限制因素導致無法進一步聚磷。亞硝酸鹽在360min處開始有明顯的累積現象，此時聚磷基本完成，分析認為：亞硝酸鹽為反硝化（聚磷）過程中的不完全反硝化（聚磷）產物或中間產物，有文獻表明：亞硝酸鹽在低濃度下可作為反硝化聚磷的電子受體［20］，因此在240～360min過程中產生的亞硝酸鹽可作為電子受體進行反硝化聚磷，在360min之后DPB胞內的PHB耗盡不能進一步消耗亞硝酸鹽，由此造成了亞硝酸的累積；另外好氧段曝氣使吸附在污泥表面的亞硝酸鹽吹脫入水中，也可能是造成亞硝酸鹽的升高的原因之一。

在表觀上可以看出，通過上述2階段的培養污泥已經具有較強的釋磷聚磷能力，故判斷反硝化污泥培養成功。

2.3 硝化菌的富集和馴化

硝化菌是化能自養菌，硝化反應需要滿足好氧條件并保持一定的堿度。從第12周期開始對進水、好氧結束和出水的氨氮進行測定，結果如圖8所示。在首次測定時進水濃度為42.3mg·L－1，但出水氨氮高達15.3mg·L－1，因此降低了進水氨氮濃度，采取了逐步增加進水氨氮濃度的方法，取得了良好的效果。氨氮去除量由27.2mg·L－1逐漸增加到50.7mg·L－1，去除效率也由初始的64.3%上升并穩定在98.5%以上。

圖8 硝化污泥培養過程中各階段水中氨氮濃度隨周期的變化

在硝化污泥培養結束后對一周期的氨氮和硝酸鹽的變化進行了監測，如圖9所示，在420min左右完成硝化反應，氨氮的去除和硝氮的生成基本符合零級反應。

圖9 硝化污泥培養末期一周期氨氮、硝氮變化曲線

根據 Monod方程［21］和比硝化速率的物理意義，有其中：CNH3為t時刻的氨氮濃度；vmax，NH3為比硝化速率；Ks，NH3為 氨 氮 飽 和 常 數。有文獻表明：Ks，NH3＝100.051t－1.158［22］，20℃時Ks，NH3＝0.7mg·L－1＜＜CNH3，氨氮以最大速度進行硝化反應，呈零級反應關系。對氨氮的去除進行曲線擬合得到vmax，NH3Cx＝0.1134mg／（L·min－1），將Cx＝2.76g／L帶入，得到vmax，NH3＝0.002 4h－1，這與文獻［19］中計算出的vmax，NH3＝0.002 2～0.003 1h－1相近。經過此階段的培養在表觀上可以看出污泥已經具有較強的硝化能力，故判斷硝化污泥培養成功。

2.4 FISH及SEM分析

上述內容從表觀上表明了雙污泥培養成功，但仍未能定性判斷是否存在大量的硝化菌和聚磷菌，因此進行了FISH檢測并使用SEM進行污泥大致形態的觀察。圖10、圖11分別為雙污泥的FISH及SEM測定照片。從圖片可以明顯看出硝化污泥和反硝化污泥在各自的系統中已經大量存在。

圖10 雙污泥FISH圖片

圖11 雙污泥SEM圖片

從SEM照片可知，雙污泥系統中均存在大量密實的菌膠團，絲狀菌構成了菌膠團的主要骨架。從形態上來看，硝化菌膠團主要以橢球狀和棒狀的球菌或者短桿菌為主，寬度在0.5～1μm左右。反硝化聚磷污泥中細菌的形態更豐富，主要有球菌、雙球菌、螺旋菌、短桿菌和長桿菌等組成。

2.4 A2N－SBR運行效果

反硝化除磷污泥和硝化污泥馴化成功后，采用A2N－SBR［23］工藝進行脫氮除磷試驗。A2－SBR和N－SBR的有效體積均為65L，A2－SBR和NSBR進水前泥水混合物均約為15L，處理水量約為50L，容積交換比為0.70～0.77。如表1和圖12所示，進水COD、氨氮、磷濃度分別為188.0、54.8、7.25mg／L時，去除率分別為98.6%、76.7%和94.1%，具有良好的脫氮除磷效果。

表1 A2N－SBR雙污泥工藝各階段對污染物去除效果mg·L－1

厭氧階段反硝化聚磷菌碳源以PHB的形式儲存在胞內同時釋磷，COD去除量為157.2mg·L－1，占其總去除量的89.7%，釋磷量為22.0mg·L－1。根據Ekenfelder提出的底物代謝速率遵循一級反應動力學的規律，則厭氧段DPB攝取碳源速率為：raacnaerobic可推導出Cac＝Cac0e－KacCxt。其中為厭氧狀態下碳源的消耗速率；Cac為碳源濃度；Kac為碳源去除速率常數；Cac0為碳源初始濃度。

圖12 A2N－SBR雙污泥工藝脫氮除磷效果

E Murnleitner根據反硝化除磷原理和計量學推導出的模型［24］有：

由于存在容積交換比，在硝化段初始，磷、氨氮的濃度被稀釋為38.0、23.9mg·L－1。氨氮硝化按照零級反應硝化率為100%，磷濃度維持不變，COD在此階段也有少量的去除。硝化階段結束后，將沉淀后的上清液由N－SBR轉入A2－SBR，因此需再次考慮容積交換比，缺氧初始硝酸鹽量被稀釋為23.7mg·L－1，同時磷濃度也被稀釋。由于在厭氧結束后部分泥水混合物（約15L）仍存在于A2－SBR中，這部分泥水混合物含有厭氧結束段的氨氮、COD和磷，因此在硝化液進入A2－SBR后即缺氧段初始氨氮和COD濃度升高，但磷同時受到容積交換的稀釋作用，故磷濃度變化不大。反硝化聚磷基本在25min內完成，硝酸鹽去除量和聚磷量分別為18.5、22.9mg·L－1。

對于缺氧速率反應動力學可與好氧聚磷進行對比。以下為E Murnleitner等提出的好氧聚磷動力學和缺氧動力學方程。

式（1）中由于在好氧狀態下氧氣充足，因此開關函數MO2為1，同理在缺氧條件下基本不存在，因此MO2為0。因此對比兩式可以發現僅相差而與的反應級數應相同，需要注意的是兩者的fpp和Cp不同，因此缺氧聚磷速度仍可以用一級反應動力學擬合，但速率常數不相同。擬合結果為Kp，NO3－＝0.74L／（g·h）。

與2.2中DPB培養階段周期試驗相比，聚磷時間、聚磷量和聚磷速率均有所減少，缺氧聚磷量占總聚磷量百分比僅為78%，分析認為這是由于試驗中不同的限制因素引起的。如前所述，在DPB培養的周期試驗中，缺氧末端PHB成為了反硝化聚磷的限制因素，而A2N－SBR試驗和DPB培養周期試驗中的釋磷量相近，但超量聚磷量遠遠沒有達到DPB培養周期試驗中的超量聚磷量，同時好氧階段發生了聚磷，說明DPB胞內的PHB在缺氧階段并沒有完全利用，缺氧聚磷量的減少時由缺乏硝酸鹽引起的。從試驗結果可知：N－SBR的硝化效率為100%，那么硝酸鹽的缺乏的主要原因主要有兩方面：1）污水在厭氧結束時由A2－SBR向N－SBR轉入時稀釋氨氮；2）污水在硝化結束時由N－SBR向A2－SBR轉入時稀釋硝酸鹽。后者隨著運行周期的增長可被解決：硝化沉淀后N－SBR中會存有上一周期的硝酸鹽，可以減弱稀釋作用。前者只有通過盡量提高容積交換比來達到，使更多的氨氮轉入N－SBR進行硝化反應，同時可降低出水的氨氮濃度，但是容積交換比與污泥的沉降性能具有一定的關系，提高存在一定的限度，這方面還需要進一步研究。

3 結 論

1）采用2階段的運行方式進行反硝化聚磷污泥的培養，第1階段為厭氧／好氧的運行方式，采取高磷濃度進水抑制PAOs其競爭菌種GAOs的生長。此階段最大釋磷量、聚磷量和除磷量分別為77.2、89.4、25.0mg·L－1；第2階段采用厭氧／缺氧／好氧的運行方式，通過減少碳源投加量抑制DPB競爭菌種反硝化菌的生長，缺氧聚磷量占總聚磷量的百分比上升至96%以上。

2）采取了逐步增加進水氨氮濃度的方法培養硝化菌，氨氮去除量由27.2mg·L－1逐漸增加到50.7mg·L－1，去除效率也由初始的64.3%上升至98.5%以上。

3）硝化速率和反硝化速率滿足零級動力學方程，比硝化速率常數為0.002 4h－1；好氧聚磷速率和缺氧聚磷速率均滿足一級動力學方程，速率常數分別是0.377、0.740L／（g·h－1）。

4）利用馴化培養成功的反硝化聚磷污泥和硝化污泥進行了A2N－SBR試驗。在進水COD、氨氮和磷分別為188.0、54.8、7.25mg／L時，去除率分別為93.5%、76.7%、94.1%，馴化培養的雙污泥具有良好的脫氮除磷效果。

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