以Fe（Ⅲ）為電子受體的聚磷菌篩選、鑒定及聚磷特性

任麗平，張 智，唐 赟

（1.重慶大學 城市建設與環境工程學院，重慶400030；2.西華師范大學 生命科學學院，四川南充637002）

現代污水生物強化除磷法是通過聚磷菌超量攝取廢水中的磷，以聚磷酸鹽的形式積累于細胞內，然后作為剩余污泥排出，從而實現磷的去除。在該過程中聚磷菌起著關鍵的作用，目前研究表明假單胞菌屬（Pseudomonas）是生物除磷的重要功能菌，是厭氧／好氧條件下的主要菌種之一［1］，并在試驗過程中一直保持著較為穩定的優勢地位［2］。目前，僅發現其超量吸磷反應的電子受體有2類，一類是以O2為電子受體，在好氧條件下完成吸磷，另一類是以NO3－、NO2－為電子受體，在缺氧條件下完成吸磷，前者稱為好氧聚磷菌（APB），后者稱為反硝化聚磷菌（DPB）［3］。同時，該過程受到溶氧、有機物、pH值［4］、厭氧時間［5］、金屬離子［6］以及 NO3－、NO2－濃度［7］等因素的影響。目前，生物除磷仍處于發展階段，生物除磷效果不穩定，大多數學者集中于除磷工藝的改進，而相關的機理研究還不夠成熟。對聚磷機理研究的最大障礙是高活性聚磷菌的獲得，至今分離、鑒定的聚磷菌仍然是極少數［8］，新的分離方法仍在不斷探索中［9］。而人們利用分子工具對污水反應器的調查結果表明污水微生物具有多樣性，許多未培養微生物被發現在脫磷中扮演著重要角色［10］。

為達到較好的除磷效果，大多數城市污水處理廠采用生物化學協同除磷工藝，充分利用生物除磷費用低、化學除磷出水磷濃度低且比較穩定的優點。用于廢水除磷的化學藥劑主要有鋁鹽、鐵鹽和石灰。鐵鹽是良好的化學同步除磷藥劑，有三價鐵鹽和亞鐵鹽2種形式，人們關注了其在除磷中的作用［11－12］，并對生化聯合除磷工藝中主要參數的控制指標進行了試驗研究，但對其機理分析不夠深入。Fe（Ⅲ）還原是地球上最早的呼吸形式之一［13］，不少的微生物種類都具有以Fe（Ⅲ）為電子受體的能力或潛能。迄今，研究人員已經從各種厭氧環境中分離得到了種類不同的Fe（Ⅲ）還原微生物，包括活性污泥中的鐵還原微生物［14］。活性污泥中的鐵還原微生物與聚磷菌有無關系、聚磷菌能否以Fe（Ⅲ）為電子受體以及Fe（Ⅲ）的生物化學協同除磷具體情況如何，至今未見研究報道。

微生物可培養性低的主要生態學原因是細菌共同協作的自然生存方式的崩潰、生境的極度營養化和生態位巨變等。混合培養、稀釋培養和模擬自然培養等研究手段和策略，可在不同程度上解決可培養性低的問題。該實驗采用稀釋培養法從活性污泥中篩選、分離出以Fe（Ⅲ）為電子受體的高活性聚磷菌，并對其進行生理生化特征、16SrDNA進化分析和厭氧聚磷特性研究，旨在為豐富聚磷菌種、進一步深入研究聚磷機理和充分發揮Fe（Ⅲ）的生物化學協同除磷作用以及實現高效低耗的除磷奠定基礎。

1 材料

活性污泥取自某城市污水處理廠厭氧段、缺氧段、好氧段各2份，共6份。

2 方法

2.1 培養基

1）牛肉膏蛋白胨液體培養基（L－1）：牛肉膏5g，蛋白胨10g，pH7.0。

2）LB固體培養基（L－1）：NaCl 10g，酵母粉5g，蛋白胨10g，pH7.0。

3）檸檬酸鐵液體培養基（L－1）：檸檬酸鐵3.4g，NH4Cl 1g，CaCl2·2H2O 0.07g，MgSO4·7H2O 0.6g，K2HPO4·3H2O 0.733g，KH2PO40.25g，葡萄糖10g，pH6.5－7.0。

4）無鐵液體培養基（L－1）：NH4Cl 1g，CaCl2·2H2O 0.07g，MgSO4·7H2O 0.6g，K2HPO4·3H2O 0.733g，KH2PO40.25g，葡萄糖10g，pH6.5－7.0。

2.2 菌株的分離及純化

分別取6份活性污泥原液逐級稀釋至10－4，將稀釋后的活性污泥分別加于牛肉膏蛋白胨液體培養基的培養皿中，27℃厭氧靜置培養9h，然后好氧培養15h（即參照A／O工況馴化培養）。將擴大培養后的菌液分別涂布在LB固體培養基上，重復以上條件馴化培養1d。挑取單菌落純化至菌落特征一致，無異常菌落出現者，可認為是單菌落。挑取單一菌落接種到斜面培養基上保存、備用。

2.3 菌株的內聚物染色

將單一菌落分別接種于LB固體平板培養基上，27℃下厭氧培養9h，進行PHB染色，再好氧培養15h，進行poly－P染色。將具有雙染色特征的菌株接種在甘油管中保存、備用。

2.4 具有還原Fe（Ⅲ）的聚磷菌株的篩選

活化具有雙染色特征的菌株，接種于充滿經稀釋10倍的檸檬酸鐵和無鐵液體培養基的試管中，厭氧避光27℃靜置培養，觀察培養基顏色變化。

2.5 菌株的16SrDNA分析

提取目標菌總DNA，以總DNA為模板擴增其16SrDNA。PCR反應體系（50μL）：無菌去離子水37.5μL，10×Buffer 5.0μL，MgCl23μL，10mmol／L dNTPs1.0μL，10μmol／L引物1（5'－CCGA ATTCGTCGACAACAGAGTTTGATCCTGGCTC AG－3'）1.0 μL，引 物 2（5'－CCCGGGATCCAA GCTTAAGGAGGTGATCCAGCC－3'）1.0 μL，Taqplus聚合酶（5U／μL）0.5μL，模板DNA 2μL。反應程序：94℃預變性5min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸10min，30個循環，72℃繼續延伸5min，4℃保溫2h。PCR反應產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳EB染色后，用紫外分析儀檢測。用上海生工的UNIQ－100DNA膠純化試劑盒回收瓊脂糖凝膠上的PCR產物，用TaKaRaPMD19－T載體試劑盒進行連接，轉化E.coli DH5α的感受態細胞，然后在含氨芐青霉素Amp／IPTG／Xgal的平板上篩選白斑，并進行菌體PCR初步檢測，再經堿裂解法提取質粒，其產物進行電泳檢測。16SrDNA的測序由上海生工完成。用BLAST軟件，將測定得到的16SrDNA全序列遞交于GenBank，并與GenBank／EMBL／DDBJ中的已知序列進行同源性分析。

2.6 厭氧聚磷菌株的聚磷特性研究

活化具有還原Fe（Ⅲ）的聚磷菌株，接種于充滿經稀釋10倍的檸檬酸鐵液體培養基的試管中，厭氧避光27℃靜置培養，每5h測定培養基中上清液磷濃度、沉淀磷濃度、菌體含磷量、Fe（Ⅱ）濃度和菌OD值。

測定方法參照國家環保總局頒布的標準分析方法。磷采用鉬銻抗分光光度法700nm測定；Fe（Ⅱ）采用鄰菲啰啉分光光度法510nm測定；OD值采用分光光度600nm測定；聚磷菌的菌體含P量的測定方法為，取菌懸液以12 000r／min離心10min，用無菌水溶解，再離心，重復3次得濕菌體，于105℃烘至恒重，稱菌體干重。在無菌條件下，取菌液用超聲波破碎菌體（破碎條件：輸出功率為200W，工作時間4s，間隔時間4s，共破碎180次）后，再用過硫酸鉀進行消解，按總磷測定方法測菌體含磷量。

3 結果與分析

3.1 菌株的篩選和分離

從6份樣品中共分離純化出36個形態不同的菌落，經PHB染色和polyP染色，具有雙染色特征即含PHB顆粒和異染顆粒的單菌落8株，初步判斷具有聚磷特征，分別編號為AP3、AP4、AP5、AP7、AP8、AP9、AP10、AP11。

初選的8株聚磷菌經厭氧培養3d后，AP3、AP7、AP11 3個試管中的顏色變淺，見圖1a，沒有編號的試管為無菌對照組；培養7d后，AP3、AP7、AP11試管中顏色完全變白，見圖1b。已知可溶性Fe（Ⅲ）到可溶性Fe（Ⅱ）的氧化還原電勢（＋0.77V）同O2還原為水的氧化還原電勢（＋0.82V）很接近，厭氧條件下，不少微生物具有利用Fe（Ⅲ）進行呼吸獲能的能力。培養基顏色變白表明其中的檸檬酸鐵被還原，AP3、AP7、AP11菌株具有還原Fe（Ⅲ）的功能。

圖1 菌株AP3厭氧培養顏色

3.2 菌株AP3的16SrDNA鑒定

菌株AP3序列測定結果的基因登錄號為HM628703。在GenBank上用Blast程序對菌株進行核苷酸同源性比對，菌株AP3與Pseudomonas mosselii ATCCBAA－99［15］的同源性為99%，菌株AP3系統發育進化樹如圖2。

圖2 基于假單胞菌屬內16SrDNA序列同源性構建的系統發育樹

從圖2中可以看到菌株AP3與菌株Pseudomonas mosselii ATCCBAA－99聚到一起，親緣關系較近。根據形態觀察、生理生化和16SrDNA序列比對確定菌株AP3為Pseudomonas mosselii。假單胞菌屬是生物除磷的重要功能菌，其好氧聚磷和反硝化聚磷特征也有不少的研究報道。本實驗分離假單胞菌屬的聚磷菌作為研究對象，具有代表性，旨為大規模污水處理廠的工程化應用打下良好的基礎。

3.3 菌株AP3的厭氧聚磷特性

如圖3，菌株AP3在有Fe（Ⅲ）的培養基中比在無Fe（Ⅲ）的培養基中生長好。這是由于在厭氧條件下，菌株利用Fe（Ⅲ）作為呼吸鏈末端電子受體，氧化體內的基質，進一步轉化為其生長發育和功能發揮所需的能量，從而使Fe（Ⅲ）還原為Fe（Ⅱ）。如圖4，菌株AP3在無Fe（Ⅲ）的培養基中，表現出典型的厭氧釋磷特征，前5h上清液磷濃度逐漸上升，菌內磷濃度逐漸下降，釋磷量為3.68mg·L－1。在有Fe（Ⅲ）培養基的實驗中，菌株AP3先厭氧釋磷，上清液磷濃度增加，菌內磷濃度下降，釋磷量為6.62mg·L－1，釋磷量比無Fe（Ⅲ）的高；10h之后開始厭氧聚磷，上清液磷濃度下降，菌內磷濃度增加，聚磷量為5.89mg·L－1。

如圖5所示，在有菌培養基中Fe（Ⅱ）濃度逐步增加，增加量為4.39mg·L－1。在無菌對照組中，Fe（Ⅱ）濃度較穩定，平均為0.51mg·L－1。此現象表明，Fe（Ⅲ）作為電子受體，被菌株異化還原為Fe（Ⅱ）。Fe（Ⅱ）濃度經歷了一個由很緩慢變化到開始明顯增長的過程，這與水稻土中鐵的微生物還原特征相似，這主要是因為Fe（Ⅲ）成為厭氧條件下的主要電子受體以及微生物鐵還原活性的恢復都需要一定時間，即Fe（Ⅲ）的異化還原有一個啟動期，因此Fe（Ⅱ）濃度在啟動期內只有微弱得增長。本實驗中，啟動期約10h，菌株AP3此時為厭氧釋磷，磷濃度上升。10h之后Fe（Ⅲ）的異化還原進入快速期，菌株AP3厭氧吸磷，上清液磷濃度下降。該實驗中上清液Fe（Ⅱ）濃度、菌體以及上清液磷濃度的變化規律初步證實了菌株AP3能以Fe（Ⅲ）為電子受體厭氧吸磷。

兩種培養基中均有磷酸鹽沉淀，整個培養過程中磷酸鹽沉淀略有變化，在有Fe（Ⅲ）的培養基中磷酸鹽沉淀比無Fe（Ⅲ）的培養基中略多。

圖3 菌OD值曲線

圖4 培養基上清液和菌體磷濃度曲線

圖5 培養基上清液Fe（Ⅱ）濃度曲線

已知生物除磷過程中，厭氧釋磷是好氧（或缺氧）超量聚磷的基礎，釋磷速度越快，整體除磷效果也越好。工程應用中厭氧參數的主要控制指標是厭氧池水力停留時間（AHRT），目前AHRT通常根據經驗來確定，缺乏更深入的研究。不適當的AHRT設置往往會造成生物除磷污水處理廠無法正常運轉，從各地實踐和專家來看，仍然是不甚完美的工藝影響污水處理廠脫氮除磷效果。實驗表明，Fe（Ⅲ）促進聚磷菌的生長、厭氧釋磷和厭氧聚磷，在厭氧條件下，既有厭氧釋磷，又有厭氧吸磷。僅以經驗來確定厭氧時間是不夠的，建議采用釋磷情況的動態監測，根據釋磷情況合理分配厭氧、好氧時間，利用這類菌和Fe（Ⅲ）的協同作用提高除磷脫氮效果。

生化協同除磷時，化學混凝沉淀與生物處理在同一個反應器中進行，化學試劑是否對污水生物處理系統性能產生影響成為國內外相關研究人員關心的課題。但是，對化學絮凝藥劑的投加位點，通常只粗略的研究了前置、同步、后置投加，其中同步沉淀是應用最廣泛的，但缺乏對其精確投藥位點的研究。因此，可以在該研究基礎上更為深入的研究除磷藥劑的投加方案，實現節能高效的達標除磷。目前，異化Fe（Ⅲ）還原及其在污染治理中的作用受到關注［16］，可在該研究基礎上開發含鐵工業廢水再利用，鋼鐵工業的酸洗廢液是重要的FeCl3和FeSO4的來源，只要來源穩定、純度滿足要求，就可通過以廢治廢，大幅度降低除磷費用。

4 結 論

實驗分離得到具有厭氧聚磷現象的聚磷菌，根據形態觀察、生理生化和16SrDNA序列比對確定菌株AP3為Pseudomonas mosselii。進一步實驗發現：Fe（Ⅲ）促進菌株AP3的生長和厭氧釋磷，菌株AP3能以Fe（Ⅲ）為電子受體厭氧聚磷。

研究初步揭示了菌株AP3能以Fe（Ⅲ）為電子受體厭氧聚磷的現象，為進一步深入研究生物化學協同除磷和充分利用含鐵工業廢水實現高效低耗的城市污水處理提供了新的理論依據。

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