RP-HPLC法測定鹽酸卡替洛爾口腔崩解片主藥及有關(guān)物質(zhì)的含量Δ

聶延君，羅永煌，劉艷玲，田朋鑫（西南大學(xué)藥學(xué)院，重慶 400715）

鹽酸卡替洛爾（Carteolol hydrochloride，CH）是一種具有內(nèi)在擬交感活性的β受體阻滯藥，可用于心臟神經(jīng)癥（Cardiac neurosis）、小兒法洛四聯(lián)癥（Congenital fetralogy of fallot）、高血壓、心律失常、心絞痛、心肌梗死等的治療[1，2]。CH最早由日本大冢制藥株式會(huì)社于1972年研制成功，1991年收載于日本第十二版藥局方[3]，劑型有片劑、顆粒劑、滴眼劑和緩釋膠囊劑等。《中國藥典》從2000年版（二部）開始收載CH（原料藥）及其滴眼液，國內(nèi)目前僅有其滴眼劑上市。

本課題組與重慶市北碚現(xiàn)代應(yīng)用藥物研究所緊密合作，在深入研究心臟神經(jīng)癥的基礎(chǔ)上，研制開發(fā)了CH的口腔崩解片，已申請(qǐng)發(fā)明專利[4]。本文參照《美國藥典》CH普通片含量測定方法進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)主峰保留時(shí)間短，與雜質(zhì)的分離度低，且峰拖尾、柱效低、理論板數(shù)不足3 000，因此，對(duì)流動(dòng)相Na2HPO4的濃度和pH值以及其與乙腈的比例進(jìn)行了優(yōu)化調(diào)整，最終建立了測定CH口腔崩解片（CHT）主藥及有關(guān)物質(zhì)含量的反相高效液相色譜（RP-HPLC）法。

1 儀器與試藥

HPLC儀，包括二極管陣列檢測器、LC-20AD泵、LC solution液相色譜工作站、色譜柱VP-ODS C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）均為日本島津公司產(chǎn)品；色譜柱Hypersil BDS C18（大連依利特分析儀器有限公司，250 mm×4.6 mm，5 μm）；Ultimate XB C18（南京利爾實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司，250 mm×4.6 mm，5 μm）；PHS-3C型酸度計(jì)（上海虹益儀器儀表有限公司）；藥品強(qiáng)光照射實(shí)驗(yàn)箱（重慶市永興實(shí)驗(yàn)儀器廠）。

CH對(duì)照品（重慶市北碚現(xiàn)代應(yīng)用藥物研究所，批號(hào):100801，純度:99.86%）；CHT（自制，批號(hào):101027、101029、101031，規(guī)格:每片5 mg）；乙腈為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Ultimate XB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相:0.17%的Na2HPO4溶液（以1 mol·L－1的H3PO4調(diào)節(jié)pH至3.0±0.05）-乙腈＝85∶15，流速:1 mL·min－1；檢測波長:251 nm；柱溫:30 ℃；進(jìn)樣量:20 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 供試品與對(duì)照品溶液的制備。取至少20片CHT，研細(xì)，精密稱定約相當(dāng)于10 mg CH的粉末，加50 mL的流動(dòng)相溶解，轉(zhuǎn)入100 mL量瓶中，機(jī)械振搖1 h，再以流動(dòng)相定容至刻度，搖勻，過濾；精密量取續(xù)濾液10 mL，置于100 mL量瓶中，用流動(dòng)相定容至刻度，搖勻，即得供試品溶液。另取CH對(duì)照品適量，加流動(dòng)相溶解并制成每1 mL中含10 μg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.2.2 有關(guān)物質(zhì)溶液的制備。精密稱取“2.2.1”項(xiàng)下粉末適量（約相當(dāng)于CH 25 mg），流動(dòng)相溶解并定容至50 mL，過濾，續(xù)濾液作為供試液；精密量取1 mL供試液置于100 mL量瓶中，加流動(dòng)相定容至刻度，搖勻，作為對(duì)照液。

2.2.3 輔料溶液制備。按處方比例取不含CH的輔料，按“2.2.2”項(xiàng)下制備供試液的方法制備輔料溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下的5種溶液各適量，在“2.1”色譜條件下進(jìn)樣測定。結(jié)果顯示，主峰峰形對(duì)稱、尖銳，拖尾因子符合要求，主峰與輔料峰、雜質(zhì)峰及溶劑峰能很好地分離，分離度大于1.5，理論板數(shù)按CH峰計(jì)算不低于3 000，色譜見圖1、圖2。

圖1 CHT含量測定高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms of content determination of Carteolol hydrochloride oral disintegrating tablets

圖2 CHT有關(guān)物質(zhì)檢查高效液相色譜圖Fig 2 HPLC chromatograms of content determination of related substances of Carteolol hydrochloride oral disintegrating tablets

2.4 專屬性試驗(yàn)

精密量取“2.2.2”項(xiàng)下供試液5 mL置于25 mL量瓶中，制備4份，分別進(jìn)行以下操作:加入1 mol·L－1NaOH溶液，于100 ℃水浴加熱2 h；加入1 mol·L－1的HCl溶液，于100 ℃水浴加熱6 h；加入3%的H2O2溶液，于100℃水浴加熱10 min；室溫放置。上述4種溶液分別作為堿破壞、酸破壞、氧化破壞和未破壞樣品。另精密量取“2.2.3”項(xiàng)下輔料溶液5 mL置于25 mL量瓶中，制備4份，同法處理。處理完畢后，分別從中各精密量取2 mL至10 mL量瓶中，用流動(dòng)相定容至刻度，搖勻，過濾待測。另取“2.2.1”和“2.2.3”項(xiàng)下供試品和輔料粉末適量，置于（4 500±500）lx下強(qiáng)光照射10 d，10 d后取出制備成5 μg·mL－1光破壞樣品溶液。取上述10種樣品溶液，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，見圖3。

圖3 CHT專屬性試驗(yàn)高效液相色譜圖Fig 3 HPLC chromatograms of specificity test of Carteolol hydrochloride oral disintegrating tablets

由圖3可見，CH在堿及氧化條件下不穩(wěn)定，產(chǎn)生少量雜質(zhì)；在酸和光照射條件下比較穩(wěn)定，幾乎不發(fā)生降解。其中在酸條件下經(jīng)計(jì)算僅降解了1.5%，將另一酸破壞樣品置于80℃水浴24 h，降解率也僅為1.8%，表明本品在酸條件下非常穩(wěn)定。各降解產(chǎn)物與主成分峰均能達(dá)到良好分離。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密稱取CH對(duì)照品適量，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備1.25、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 μg·mL－16個(gè)不同濃度的對(duì)照品溶液，進(jìn)樣。以濃度（x，μg·mL－1）為橫坐標(biāo)，以峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得線性回歸方程為:y＝33 419x+4 040.5（r＝0.999 8）。結(jié)果表明，CH檢測濃度的線性范圍為1.25～40.0 μg·mL－1。

精密稱取CHT粉末適量，制備1.25、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 μg·mL－16個(gè)不同濃度的對(duì)照液，進(jìn)樣。同法得線性回歸方程為:y＝33 618x+3 662.7（r＝1.000）。結(jié)果表明，有關(guān)物質(zhì)對(duì)照液檢測濃度的線性范圍為1.25～40.0 μg·mL－1。

2.6 日內(nèi)精密度試驗(yàn)

按“2.2.1”方法制備10 μg·mL－1的對(duì)照品溶液，濾過，分別在下午和晚上由不同的分析人員連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果日內(nèi)RSD＝0.5%（n＝12）。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批CHT，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，進(jìn)樣測定，結(jié)果，含量的RSD＝0.54%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下供試品溶液，室溫放置，分別于0、0.5、1、2、4、6、8 h進(jìn)樣測定，計(jì)算。結(jié)果，含量的RSD＝0.16%，表明供試品溶液在室溫下8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 回收率試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試液，從中精密量取0.8、1.0、1.2 mL，置于3個(gè)50 mL的量瓶中，以“2.2.3”項(xiàng)下制備的輔料溶液稀釋、定容至刻度，濾過，進(jìn)樣，測定含量，計(jì)算回收率，結(jié)果低、中、高濃度的平均回收率分別為101.4%（RSD＝0.12%）、101.3%（RSD＝0.07%）、101.4%（RSD＝0.03%），詳見表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab 1 Results of recovery tests

2.10 最低檢測限和最低定量限測定

取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，加流動(dòng)相不斷稀釋，記錄峰面積，在信噪比（S/N）為3∶1時(shí)測得最低檢測限為6.3 ng，在信噪比（S/N）為10∶1時(shí)測得最低定量限為20.8 ng。

2.11 系統(tǒng)耐用性試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，在“2.1”色譜條件下改變流速，分別在0.8、1.0、1.2 mL·min－1時(shí)進(jìn)樣，各色譜峰的保留時(shí)間稍有位移，但峰形仍良好，分離度符合要求。選用3種色譜柱（VP-ODS C18、Hypersil BDS C18、Ultimate XB C18）進(jìn)行系統(tǒng)適用性試驗(yàn)，結(jié)果，主峰峰形、理論板數(shù)、分離度均能達(dá)到要求，結(jié)果見表2。

表2 耐用性試驗(yàn)Tab 2 Results of durability test

2.12 樣品中主藥含量測定

取3批CHT各若干片，照“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品、對(duì)照品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算樣品中主藥的含量。結(jié)果，3批樣品主藥含量在99.33%～102.00%之間，符合要求，詳見表3。

表3 CHT中主藥與有關(guān)物質(zhì)含量測定結(jié)果（±s，n＝6）Tab 3 Results of content determination of main component and related substance in Carteolol hydrochloride oral disintegrating tablet（s±s，n＝6）

表3 CHT中主藥與有關(guān)物質(zhì)含量測定結(jié)果（±s，n＝6）Tab 3 Results of content determination of main component and related substance in Carteolol hydrochloride oral disintegrating tablet（s±s，n＝6）

有關(guān)物質(zhì)含量/%0.09±0.22 0.09±0.21 0.10±0.64批號(hào)101027 101029 101031主藥含量/%102.00±1.22 101.24±1.05 99.33±1.04

2.13 樣品中有關(guān)物質(zhì)含量檢查

取3批CHT各若干片，照“2.2.2”項(xiàng)下制備供試、對(duì)照液，取對(duì)照液過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液20 μL進(jìn)樣，調(diào)節(jié)儀器靈敏度，使主成分峰高為滿量程的20%；另取供試液的續(xù)濾液20 μL進(jìn)樣，記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的2倍以上。如有雜質(zhì)峰，量取除溶劑峰和輔料峰以外的各雜質(zhì)峰面積之和，并與對(duì)照液主成分峰面積比較，以不加校正因子的自身對(duì)照法計(jì)算雜質(zhì)含量。結(jié)果，3批樣品的有關(guān)物質(zhì)含量均低于0.15%，符合要求，結(jié)果見表3。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

利用二極管陣列檢測器對(duì)CH對(duì)照品溶液掃描，結(jié)果在215、251 nm波長處均有最大吸收；對(duì)破壞性試驗(yàn)（酸、堿、氧化、光照等）后的樣品溶液掃描，其最大吸收波長也多在251 nm波長處。另外，由于215 nm波長接近末端吸收，基線不易平衡。根據(jù)各主要雜質(zhì)及主成分的紫外吸收特性，選取響應(yīng)值基本一致的251 nm作為本品含量和有關(guān)物質(zhì)的檢測波長。

3.2 流動(dòng)相的選擇

《美國藥典》收載的CH片的含量測定，其流動(dòng)相為0.07%的Na2HPO4（pH6.0）-乙腈（75∶25）[5]。筆者自制的CHT，在此流動(dòng)相下保留時(shí)間僅為3.8 min，且峰拖尾、柱效低、理論板數(shù)低于2 000。本文將Na2HPO4的濃度增加到0.17%時(shí)，柱效提高，理論板數(shù)在6 000左右；其pH值從原來的6.0調(diào)節(jié)至3.0時(shí)，峰形最好；將磷酸鹽溶液與乙腈的比例從75∶25調(diào)整為85∶15，主峰的保留時(shí)間由3.8 min變?yōu)?.7min，此時(shí)主峰與溶劑及有關(guān)物質(zhì)峰能完全分離。

[1]Nagashima M，Akiko O，Sanity M，et al.The clinical trials of β-blocker agent carteolol in the field of pediatrics[J].Clin Pediatr，1983，36（2）:415.

[2]劉 慧.新受體阻斷劑-鹽酸卡替洛爾的研究進(jìn)展[J].天津藥學(xué)，1992，11（1）:15.

[3]鹽酸卡替洛爾片.JAPIC藥品說明書[EB/OL].http://www.genome.jp/kusuri/japic_med/show/0052337.2011-06-09.

[4]羅永煌，聶延君，喬彥茹，等.鹽酸卡替洛爾口腔崩解片及其制備方法[P].CN:101690720，2010-04-07.

[5]The United States Pharmacopeial Convention.USA Pharmacopoeia（USP32-NF27）.Carteolol Hydrochloride Tablets[EB/OL].http://www.drugfuture.com/Pharmacopoeia/usp32/pub/data/v32270/usp32nf27s0_m13670.html.2009-05-01.2011-03-26.