動態(tài)濁度法檢測乳酸左氧氟沙星氯化鈉注射液中的細菌內(nèi)毒素

李榮，吳玲（1.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院，湖南衡陽41001；.衡陽市藥品檢驗所，湖南衡陽41001）

乳酸左氧氟沙星氯化鈉注射液（Levofloxacin lactate and sodium chloride injection，LSI）臨床應(yīng)用廣泛，可對抗由敏感菌引起的呼吸系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)、消化及皮膚軟組織等急、慢性感染。現(xiàn)行質(zhì)量標準中熱原檢查采用經(jīng)典的家兔法，而細菌內(nèi)毒素法較家兔法快速、靈敏、準確、經(jīng)濟。有報道[1]使用凝膠法檢測該藥的細菌內(nèi)毒素，但此法為限量檢查法，不能準確測定樣品中的細菌內(nèi)毒素含量，而定量法鱟試驗則可提供更靈敏而準確的細菌內(nèi)毒素檢測方法。筆者采用檢測細菌內(nèi)毒素的動態(tài)濁度法，對LSI進行添加細菌內(nèi)毒素的回收試驗，并考察了干擾因素（檢測波長、pH值）對結(jié)果的影響，建立了LSI的細菌內(nèi)毒素定量檢查法，為臨床安全用藥提供技術(shù)保障。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

BET-32M細菌內(nèi)毒素檢測儀（天津大學(xué)無線電廠）；UV-2550型紫外分光光度計（日本島津公司）；PHS-3C型酸度計（衡陽市應(yīng)用技術(shù)研究所）；ZH-2型自動漩渦混合器（天津藥典標準儀器廠）；試管、反應(yīng)試管、吸頭均經(jīng)250℃烘烤2 h以上除熱原。

1.2 試藥

細菌內(nèi)毒素檢查用水（BET水，批號:100404，規(guī)格:每支5 mL，內(nèi)毒素含量＜0.005 EU·mL－1）、鱟試劑（批號:1003011，規(guī)格:每支0.6 mL，標示靈敏度λ＝0.03 EU·mL－1）均為湛江博康海洋生物有限公司產(chǎn)品；細菌內(nèi)毒素工作標準品（CSE，中國食品藥品檢定研究院，批號:981，規(guī)格:每支9 000 EU）；LSI（浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠，批號:101234、110113、110136，規(guī)格:300 mg·100 mL－1）。

2 方法與結(jié)果

2.1 LSI的細菌內(nèi)毒素限值（L）的確定

按2010年版《中國藥典》規(guī)定[2]，L＝K/M，其中K為人用每kg體重每小時最大可接受的內(nèi)毒素劑量，K＝5 EU/（kg·h）；M為每kg體重每小時最大供試品劑量，由于LSI靜脈滴注過快易引起靜脈刺激癥狀或中樞神經(jīng)系統(tǒng)反應(yīng)，故每小時人體最多可以接受的量為100 mL。人均體重按60 kg計算，則L＝3 EU·mL－1。此值明顯高于一般大容量輸液細菌內(nèi)毒素限值0.5 EU·mL－1，考慮到藥品使用安全性要求及一般大容量輸液細菌內(nèi)毒素限值要求，將本品的L定為0.5 EU·mL－1為宜。

2.2 標準曲線的可靠性試驗

用BET水對CSE進行稀釋，使其細菌內(nèi)毒素最終濃度分別為2.0、0.5、0.125、0.031 25 EU·mL－1，各取0.15 mL分別加到預(yù)先加有0.15 mL鱟試劑的反應(yīng)管內(nèi)，混合均勻，插入細菌內(nèi)毒素檢測儀內(nèi)進行檢測，每濃度平行3管；同時用BET水與鱟試劑反應(yīng)作為陰性對照，平行3管，反應(yīng)溫度為（37±1）℃，工作波長為450 nm，預(yù)設(shè)吸光度為0.02。結(jié)果見表1。

經(jīng)整理得標準曲線回歸方程為lgT＝2.974 60－0.376 14 lgc（T為反應(yīng)時間，c為溶液中細菌內(nèi)毒素濃度），其相關(guān)系數(shù)r＝－0.998 8（絕對值應(yīng)大于0.98），反應(yīng)時間在710～347 2 s，而陰性對照管反應(yīng)時間＞3 600 s，標準曲線最低細菌內(nèi)毒素濃度點λ1＝0.031 25 EU·mL－1，陰性對照管在檢測時間外，因此標準曲線成立。

表1 標準曲線的可靠性試驗（n＝3）Tab 1 Reliability test of standard curve（n＝3）

2.3 樣品最大稀釋倍數(shù)（MVD）及干擾試驗

按照公式 MVD＝L/λ1，其中λ1為標準曲線的最低濃度0.031 25 EU·mL－1，計算得樣品試驗時MVD為16倍。將LSI用BET水依次稀釋為2、4、8、16倍，記為Ai液；同時另取4管，進行同樣倍數(shù)的稀釋，并在稀釋液中添加細菌內(nèi)毒素濃度（λm）為0.25 EU·mL－1的細菌內(nèi)毒素標準溶液，記為Bi液，進行回收試驗。分別取上述各液0.15 mL加到預(yù)先加有0.15 mL鱟試劑反應(yīng)管內(nèi)，混合均勻，插入細菌內(nèi)毒素檢測儀內(nèi)進行檢測，每濃度重復(fù)2管，檢測條件同“2.2”項下。測定結(jié)束后，按標準曲線回歸方程分別計算出供試品溶液和含標準細菌內(nèi)毒素λm的供試品溶液的細菌內(nèi)毒素含量，計算回收率（Bi/0.25×100%），結(jié)果見表2。

表2 干擾試驗（n＝2）Tab 2 Interference test（n＝2）

由表2結(jié)果可見，LSI的2～16倍稀釋液回收率雖均在50%～200%范圍內(nèi)，符合有關(guān)要求[2]，但由于2倍稀釋液的回收率接近50%，故在日常檢查中以其8倍（3 mg·mL－1/8＝0.375 mg·mL－1）稀釋液為好。

2.4 動態(tài)濁度法與凝膠法比較

取樣品8倍（0.375 mg·mL－1）稀釋液，按《中國藥典》2010年版二部動態(tài)濁度法與凝膠法[2]進行檢查，處理方法同“2.3”項下，檢測結(jié)果表明2種方法結(jié)果一致，均符合規(guī)定，詳見表3。

表3 動態(tài)濁度法與凝膠法檢測結(jié)果比較Tab 3 Comparison of the results of KTA and gel-clot test

2.5 消除干擾因素的試驗

2.5.1 對檢測光源（450 nm）的吸收試驗。將LSI（批號為101234）用BET水稀釋成下列濃度:2倍（1.5 mg·mL－1）、4倍（0.75 mg·mL－1）、8 倍（0.375 mg·mL－1）、16倍（0.187 5 mg·mL－1），用紫外分光光度計測定450 nm波長處吸光度，分別為:0.001、－0.002、0.001、－0.003。可見，LSI對檢測光源（450 nm）吸收很弱，隨著供試品的稀釋，吸光度的變化不大，故光源吸收不是主要的干擾因素。

2.5.2 pH值試驗。將LSI同“2.5.1”項下試驗方法系列稀釋后用酸度計測定pH值，結(jié)果分別為4.93（1.5 mg·mL－1）、4.87（0.75 mg·mL－1）、4.89（0.375 mg·mL－1）、4.96（0.187 5 mg·mL－1）。pH值接近6～8范圍，“除非有特殊的要求，否則在各論中樣品和鱟試劑在檢測混合物pH值范圍為6.0～8.0”[3]，由于鱟試劑本身具備一定的緩沖能力，故pH值也不是干擾動態(tài)濁度法的主要因素。

3 討論

LSI的4～16倍（0.75～0.187 5 mg·mL－1）稀釋液的回收率均在90%～200%范圍內(nèi)，表明在此試驗條件下供試品溶液對鱟試劑不存在干擾作用。由于LSI供試品溶液對檢測光源的吸收很弱，pH值接近6～8范圍，且其采用動態(tài)濁度法與凝膠法檢查結(jié)果一致，所以認為LSI上述濃度稀釋液用動態(tài)濁度法進行細菌內(nèi)毒素檢測是可行的。

動態(tài)濁度法是檢測反應(yīng)混合物的濁度到達某一預(yù)先設(shè)定的吸光度所需要的反應(yīng)時間，或是檢測濁度增加速度的方法。基于細菌內(nèi)毒素與鱟試劑的反應(yīng)是由于一系列酶促放大作用而產(chǎn)生的，故其干擾因素較多，主要包括供試品的酸堿度、金屬離子濃度、非特異性鱟試劑激活物、對儀器檢測光源（450 nm）的吸收干擾等。按照《中國藥典》2010版（二部）附錄指導(dǎo)原則[2]，一般采用稀釋法可消除這種干擾。

利用動態(tài)濁度法進行細菌內(nèi)毒素定量檢測，具有操作簡便、結(jié)果準確、靈敏度高等優(yōu)點。國外細菌內(nèi)毒素定量法的使用率已超過凝膠法，約占65%～70%[4]。此法廣泛應(yīng)用于小容量注射液與大輸液混合后的細菌內(nèi)毒素檢查，對于臨床輸液質(zhì)量的控制可提供科學(xué)有效的依據(jù)。

[1]李海英，王瓊芬.乳酸左氧氟沙星氯化鈉注射液的細菌內(nèi)毒素檢查[J].中國藥業(yè)，2008，17（12）:55.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）[S].2010年版.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄ⅪE.

[3]United States Pharmacopeia Convention Inc.The United States Pharmacopeia[S].23rd.Easton:Easton Publishing Co.，1995:Appendix 1 969.

[4]李楚云，詹云麗.輸液熱原反應(yīng)與細菌內(nèi)毒素的定量研究[J].中國實用醫(yī)藥，2010，5（10）:230.