HPLC法測定沙利度胺片中有關物質的含量

邱 娟，伍良涌（廣州市藥品檢驗所，廣州 510160）

沙利度胺為谷氨酸衍生物，最早作為鎮靜藥和鎮痛藥用于治療妊娠惡心、嘔吐，后因其嚴重的致畸和神經毒性副作用而退出市場。研究[1]發現沙利度胺與抗麻風病藥合用可以減少麻風反應，治療各型麻風證如結節性紅斑。另有研究[2]發現沙利度胺對人類免疫缺陷病毒（HIV）感染、腫瘤引起的惡液質、卡伯氏肉瘤、口腔潰瘍以及慢性移植物抗宿主反應病等有療效。沙利度胺片的質量標準收載于國家藥品標準[3]中，但其標準中未收載有關物質檢查項。國內、外藥典中僅《美國藥典》收載其膠囊劑，筆者參考《美國藥典》沙利度胺膠囊劑項下有關物質檢查方法[4]并結合國內實際生產情況建立了準確、可靠，且專屬性強的測定沙利度胺片有關物質含量的高效液相色譜（HPLC）法，結果表明該法能夠很好地控制產品質量，保證用藥安全。由于本品在中性或堿性條件下易降解生成鄰苯二甲酸，因此采用鄰苯二甲酸作為有關物質檢查的對照品。

1 儀器與試藥

1200型HPLC儀（美國Agilent公司）。

沙利度胺標準品（批號:100504-200501，純度:100.0%）、鄰苯二甲酸標準品（批號:100903-200601，純度:100.0%）均由中國食品藥品檢定研究院提供；沙利度胺片（常州制藥廠有限公司，批號:0710081、07122714，規格:每片 25 mg；批號:0710091、07111513，規格:每片50 mg）；乙腈為色譜純，磷酸為分析純，水為去離子水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱:Waters Nova-Pak C18（150 mm×3.9 mm，4 μm）；流動相:水-乙腈-磷酸（梯度洗脫），水-乙腈-磷酸＝95∶5∶0.1為流動相A，水-乙腈-磷酸＝85∶15∶0.1為流動相B；梯度洗脫程序:0 min流動相A為100%、流動相B為0，0～15 min流動相A由100%變為50%、流動相B由0變為50%，15～20 min流動相A由50%變為100%、流動相B由50%變為0，20～30 min流動相A為100%、流動相B為0，流速:2.0 mL·min－1；檢測波長:218 nm；柱溫:40 ℃；進樣體積:200 μL。

2.2 系統適用性試驗

稱取沙利度胺標準品適量，加乙腈溶解并稀釋制成每1 mL中含1 mg的溶液，作為溶液a；另取鄰苯二甲酸適量，用乙腈-水（80∶5）混合液溶解并定量稀釋制成每1 mL中含1 mg的溶液，精密量取適量，用乙腈稀釋制成每1 mL中含0.1 mg的溶液，作為溶液b；精密量取溶液a、b各2 mL，置于同一100 mL量瓶中，用水-乙腈-磷酸（50∶50∶0.1）混合液稀釋至刻度，搖勻，精密量取10 mL置于100 mL量瓶中，加入磷酸溶液（1→100）10 mL，加水稀釋至刻度，搖勻。按“2.1”項下色譜條件進樣測定。結果，沙利度胺峰的保留時間約為14 min，鄰苯二甲酸峰的相對保留時間約為0.3。色譜見圖1。

2.3 溶液的制備

2.3.1 供試品溶液的制備:取沙利度胺片細粉適量（約相當于沙利度胺0.1 g），精密稱定，置于50 mL量瓶中，加水-乙腈-磷酸（50∶50∶0.1）混合液適量，超聲振蕩使溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過；精密量取續濾液10 mL置于100 mL量瓶中，加入磷酸溶液（1→100）10 mL，加水稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

圖1 系統適用性試驗高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms of system suitability test

2.3.2 標準品溶液的制備:取鄰苯二甲酸標準品適量，用乙腈-水（80∶5）混合液溶解并定量稀釋制成每1 mL中含1 mg的溶液，精密量取適量，用乙腈稀釋制成每1 mL中含0.1 mg的溶液；再精密量取2 mL，置于100 mL量瓶中，用水-乙腈-磷酸（50∶50∶0.1）混合液稀釋至刻度，搖勻，作為標準品貯備液。精密量取標準品貯備液10 mL置于100 mL量瓶中，加入磷酸溶液（1→100）10 mL，加水稀釋至刻度，搖勻，作為標準品溶液。

2.3.3 空白輔料的制備:按處方比例制備不含沙利度胺的空白輔料，按“2.3.1”項下方法制備空白輔料溶液。

2.4 專屬性試驗

取“2.3.1”項下供試品溶液10 mL 5份分別用稀鹽酸溶液、10%氫氧化鈉溶液、30%過氧化氫溶液、365 nm紫外燈照射及沸水浴加熱進行破壞后，進樣測定，同時取未破壞供試品溶液進樣分析。結果表明，本品在強酸、強堿、氧化、高溫、光照等劇烈條件下均產生多個雜質峰，對于強堿尤為敏感；建立的色譜條件對雜質峰能進行分離，色譜見圖2。

圖2 專屬性試驗高效液相色譜圖Fig 2 HPLC chromatograms of specification test

2.5 標準曲線的制備

分別精密吸取“2.3.2”項下標準品貯備液1、2、5、10、15、20 mL，置于不同100 mL量瓶中，加10 mL磷酸溶液（1→100），加水定容至刻度，分別取各濃度溶液200 μL進樣測定。以峰面積（Y）為縱坐標，濃度（X）作為橫坐標，繪制標準曲線，求得鄰苯二甲酸回歸方程:Y＝466.998X－0.584（r＝0.999 9，n＝6），表明鄰苯二甲酸檢測濃度線性范圍為0.02～0.50 μg·mL－1。

2.6 精密度試驗

取標準品溶液連續進樣6次，以鄰苯二甲酸峰面積計算RSD＝0.3%（n＝6）。

2.7 重復性試驗

按“2.3.1”項下方法制備批號為0710081的供試品6溶液份，進樣、測定。結果樣品中最大單個雜質含量的RSD＝1.5%（n＝6），雜質總量的RSD＝1.0%（n＝6），表明該方法重復性良好。

2.8 穩定性試驗

精密吸取供試品溶液分別在0、3、6、13、20 h測定，得沙利度胺峰面積的RSD＝0.1%，雜質量未有明顯增加，表明供試品溶液在20 h內穩定。

2.9 檢出限

分別取沙利度胺標準品、鄰苯二甲酸標準品適量，制成溶液，逐步稀釋進樣，記錄色譜圖，以信噪比（S/N）＝3時的濃度計算得沙利度胺的檢出限為9 ng，鄰苯二甲酸的檢出限為1.2 ng。

2.10 樣品有關物質含量測定結果

分別稱取4批沙利度胺片各2份，照“2.3.1”項下方法制備供試品溶液，進樣測定。在供試品溶液的色譜圖中，如有雜質峰，按外標法以鄰苯二甲酸峰面積計算。結果批號為0710081、07122714、0710091、07111513的樣品中最大單個雜質含量分別為0.07%、0.09%、0.08%、0.09%，雜質總量均為0.1%。

3 討論

3.1 色譜柱的選擇

從二極管陣列檢測器（DAD）記錄信號中提取鄰苯二甲酸、沙利度胺及沙利度胺主要降解產物在200～400 nm波長的光譜圖，發現最大吸收基本在218 nm波長附近，因此確定檢測波長為218 nm。

本試驗共考察了6種不同廠家牌號規格的色譜柱，分別為Welch Materials公司的Ultimate XB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），Agilent公司的ZORBAX SB C18（150 mm×3.0 mm，3.5 μm），Waters公司的Nova-Pak C18（150 mm×3.9 mm，4 μm），迪馬公司的Diamonsil C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），Phenomenex公司的Luna C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）。除Nova-Pak C18及ZORBAX SB-C182種高效柱外，其他規格的普通色譜柱分析時間較長，沙利度胺主峰的保留時間均在30 min以后，且峰形較差，理論板數較低。最終確定采用Waters公司的Nova-Pak C18，或者可采用同等柱效的色譜柱。

3.2 色譜條件的選擇

筆者采用文獻[5]報道的色譜條件進行分析，結果發現各色譜圖中主成分保留時間并不一致，且供試品檢出的雜質處于2個溶劑峰之間，易受干擾，影響雜質測定的準確性。在專屬性考察中，采用該文獻的破壞條件未有較多雜質檢出，且雜質分離情況欠佳。本研究采用較為劇烈的的破壞條件（主要指酸、堿、氧化破壞試驗中所用試劑的濃度均大于文獻報道所采用的濃度，光照及加熱破壞試驗條件也強于文獻所述的條件）使得主成分沙利度胺產生明顯的降解產物，采用所建立的色譜條件均能使降解產物有較清晰的分離，并且空白輔料峰的保留時間均在1 min內，從而避免了干擾其他雜質峰的檢出。

3.3 進樣體積的選擇

根據目前國內實際生產情況，若按常規采用20 μL進樣體積，雜質檢出量較低，不能真實反映產品的質量。曾嘗試制備濃度為2 mg·mL－1的供試品溶液而只進樣20 μL，但結果發現沙利度胺在水-乙腈-磷酸（50∶50∶0.1）混合液中的溶解性較差，無法完全溶解，影響沙利度胺片有關物質的檢出。因此最終確定制備濃度為0.2 mg·mL－1的供試品溶液而選擇進樣體積為200 μL，確保有關物質檢查準確、有效。

3.4 溶液的選擇

本研究參考《美國藥典》沙利度胺膠囊劑[4]項下方法，采用與流動相相近組成比例的混合溶液溶解樣品，能夠避免出現較為明顯的溶劑峰。沙利度胺合成原料為鄰苯二甲酸酐和谷氨酸，沙利度胺在偏酸性條件下較穩定，在中性或偏堿性條件下易分解，加入適量磷酸溶液可以避免樣品發生降解。

[1]徐浩翔.沙利度胺在皮膚科的應用進展[J].中國麻風皮膚病雜志，2009，25（11）:829.

[2]陳金月.沙利度胺的藥理作用與研究進展[J].醫藥導報，2004，23（3）:177.

[3]國家藥典委員會.國家藥品標準（化學藥品地方標準上升國家標準）第十一冊[S].北京:人民衛生出版社，2002:118.

[4]The United States Pharmacopeial Convention.The United States Pharmacopeia-The National Formulary（USP32-NF27）[S].Philadelphia:National Publishing，2008:3 704.

[5]歐貝麗，尹小英，徐菊芳，等.反相高效液相色譜法測定沙利度胺的有關物質[J].中國藥學雜志，2008，43（6）:465.