菠蘿蛋白酶水解泥鰍蛋白制備ACE抑制肽的研究

姚東瑞，盤賽昆，周鳴謙，王淑軍，胡金玲

(淮海工學院食品工程學院，江蘇 連云港 222005)

菠蘿蛋白酶水解泥鰍蛋白制備ACE抑制肽的研究

姚東瑞，盤賽昆，周鳴謙，王淑軍，胡金玲

(淮海工學院食品工程學院，江蘇 連云港 222005)

為了探討利用泥鰍蛋白制備功能性肽的可能性，采用高效液相色譜法測定泥鰍肉水解物對血管緊張素轉換酶(ACE)的抑制作用，從胰蛋白酶、胃蛋白酶、菠蘿蛋白酶、復合風味蛋白酶、復合蛋白酶5種酶中篩選出菠蘿蛋白酶作為酶解泥鰍肉制備具有降血壓活性水解物的適宜水解酶。在單因素試驗的基礎上，采用L9(34)正交試驗設計對該酶的酶解條件進行優化。結果表明最佳水解條件為：溫度55℃，固液比1:3，pH6.5，加酶量1000U/g pro，水解時間90min。在該條件下，水解物的ACE抑制率IC50值為0.0184mg/mL，ACE抑制肽的相對分子質量主要集中在924左右。

泥鰍；酶解；降血壓；血管緊張素轉換酶(ACE)；菠蘿蛋白酶

高血壓是對人類健康危害極大的一種疾病，在西方國家1/4的人群受其影響[1]，全世界每年因高血壓死亡的人數高達1200萬[2]。據國家高血壓研究中心最新統計，我國高血壓患者己達1.2億人，發病率為10.8%，其危害僅次于腫瘤[3]。血管緊張素轉換酶(angiotensin-I converting enzyme，ACE，EC 3. 4.15.1)是一種含鋅的二肽羧基肽酶[3]，是動物體內血壓控制的一種關鍵物質[4]。ACE催化血管緊張素-Ⅰ脫去C未端兩個氨基酸殘基形成活性很強的血管緊張素-Ⅱ，而血管緊張素-Ⅱ是腎素——血管緊張素調節系統中已知活性最強的血管收縮劑，它能作用于小動脈，使血管平滑肌收縮，迅速引起升壓效應；同時還能刺激醛固酮分泌和直接對腸胃作用(減少腎血流量及促進Na+、K+的重吸收)，引起鈉貯量和血容量的增加，也能使血壓升高。緩激肽是降血壓物質，ACE也能作用于緩激肽，催化從其C未端脫去兩個氨基酸殘基而使其失活，從而也使血壓升高[4]。因此，如果抑制了ACE的活性，就能有效防止和治療高血壓的發生。降血壓肽能夠競爭性地與ACE結合，從而抑制其發揮作用。自Ferreira等從蛇毒中首次發現天然ACE抑制肽以來，食源性降血壓肽具有無毒副作用、安全性高的特點而倍受科研工作者的關注[5-8]。

泥鰍(Misgurnus anguillicaudatus)系鰍科動物，肉或全體可入藥，收載于《中藥大辭典》[9]。中醫認為，泥鰍性味甘、平、無毒，具有調中益氣、壯陽祛濕等功能，可用于治療肝炎、皮膚瘙癢、水腫、黃疸和痔瘡等疾病[10-11]。泥鰍是滋補佳品，素有“水中人參”之美譽，肉質細嫩，味道鮮美，分析表明，泥鰍蛋白質含量達17%左右，谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸與甘氨酸4種鮮味氨基酸的含量遠超過其他魚類[12]，是一種高蛋白、低脂肪的高檔營養珍品[13]。泥鰍是一種食性雜、生產潛力大、很有發展前途的養殖品種，國內外市場的需求量較大[13]。我國除青藏高原外，各地的河川、溝渠、水田、池塘都有泥鰍的分布，僅連云港地區養殖水面就達16000多畝，是一種優質而豐富的蛋白質資源。近年來，如何高效利用泥鰍蛋白成為研究的焦點。利用蛋白酶專一水解特性，將蛋白質中無活性的氨基酸序列釋放為具有各種活性的肽段是一種食源性功能肽的有效制備方法[14]。You Lijun等[10]利用木瓜蛋白酶和復合蛋白酶水解泥鰍蛋白制備抗氧化活性肽，而酶解泥鰍蛋白制備降血壓肽的研究尚未見報道。

本實驗利用高效液相色譜法測定泥鰍蛋白水解物對ACE的抑制活性，以水解度(DH)和水解產物對ACE的抑制率為指標對酶解過程進行分析，旨在為利用泥鰍蛋白制備降壓肽提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活泥鰍購于連云港敦尚鎮泥鰍養殖基地，經淮海工學院水產養殖系程漢良教授鑒定為泥鰍(Misgurnus anguillicaudatus)，去頭、尾和血并洗凈，置于-40℃冰箱中冷凍備用。

復合蛋白酶(42300U/g)、復合風味蛋白酶(31800U/g) 諾維信(沈陽)生物加工有限公司；菠蘿蛋白酶(14000U/g)、胰蛋白酶(15000U/g)、胃蛋白酶(35000U/g) 廣州市齊云生物技術有限公司；ACE(從兔肺提取)、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸(HHL)、卡托普利 美國Sigma公司；乙腈、三氟乙酸(色譜純) 美國Fisher公司。

1.2 儀器與設備

日立CR22G高速冷凍離心機 日本Hitach公司；BioLogic DuoFlowTM層析系統 美國Bio-Rad公司；PHS-3C型pH計 上海精宏實驗設備有限公司；Waters600高效液相色譜儀 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 泥鰍蛋白酶解工藝流程

鮮活泥鰍→預處理(去頭、去內臟、用自來水洗凈、瀝干)→冷凍備用→解凍→加蒸餾水勻漿→調整酶解條件→酶解→滅酶(沸水浴，10min)→冷卻→調pH8.3→離心(10000r/min，30min)→取上清液→-18℃保存或凍干備用

1.3.2 蛋白酶活力測定

采用Folin-酚法，以酪蛋白為底物，參照GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》[15]附錄1方法進行測定。

1.3.3 泥鰍蛋白水解度測定

式中：CN為水解液中游離氨基氮的含量/(g/100mL)；CNO為魚糜勻漿水解前游離氨基氮的含量/(g/100mL)；C為魚糜勻漿中總蛋白氮的含量/(g/100mL)。

蛋白質及蛋白氮含量采用凱氏定氮法測定，參照GB5009.5—2010《食品中蛋白質的測定》[16]的方法進行，游離氨基氮含量采用甲醛電位滴定法測定[17]。

1.3.4 水解物ACE 抑制活性的RP-HPLC測定

參照文獻[18-20]的方法，并略有改進。ACE、HHL分別用0.1mol/L硼酸鈉緩沖液(含0.3mol/L NaCl，pH8.3)配成25mU/mL ACE溶液和8.3mmol/L HHL溶液；馬尿酸標準品用超純水配成5mg/mL的貯存液，使用時稀釋成不同濃度的使用液。取25μL樣品溶液和75μL HHL溶液混勻，于37℃保溫10min，加入50μL ACE溶液，在37℃反應60min后，加入150μL濃度為1mol/L HCl溶液終止反應，10000r/min離心15min，取上清液進行分析，同時用硼酸鈉緩沖液代替樣品溶液做空白對照。

色譜條件：SunfireTMC18柱(4.6mm×150mm，50μm)；洗脫液為15%乙腈+85%水(含0.05%三氟乙酸)；流速為1.0mL/min；檢測波長為228nm；進樣量為20μL；柱溫為30℃。按式(2)計算ACE抑制率。

式中：a為樣品組馬尿酸峰面積；b為對照組馬尿酸峰面積。

IC50定義為ACE抑制率達50%時的多肽質量濃度(mg/mL)，用SPSS13.0 統計軟件的概率單位法(probit)計算。多肽含量采用雙縮脲法測定[21]。

1.3.5 酶的篩選

取泥鰍肉10g，加水30mL，按2000U/g pro加酶量分別加入復合風味蛋白酶、復合蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶，在上述酶的適宜條件(表1)下進行酶解，以水解度及IC50為指標考察0～240min內(間隔30min)供試酶的水解進程及酶解液對ACE的抑制作用。

表1 供試酶的作用條件Table1 Hydrolysis conditions of proteases tested in this study

1.3.6 泥鰍肉水解物的相對分子質量分布測定

參照文獻[22]的方法，采用凝膠層析法測定水解物相對分子質量分布。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶的篩選趨

圖1 5種供試酶對泥鰍肉的水解進程Fig.1 Hydrolysis courses of loach protein by five proteases

如圖1所示，隨著酶解時間延長，泥鰍蛋白在不同蛋白酶作用下的水解度逐漸增加，達到150min后增加勢變緩。圖2顯示，未經水解的泥鰍肉勻漿幾乎沒有ACE抑制活性。經酶水解后，均表現出了一定的ACE抑制活性。其中，復合蛋白酶水解物的ACE抑制活性提高最快，但隨著水解程度的不斷推進，ACE抑制活性呈現無規律的波動，復合風味蛋白酶也有類似的現象，可能是因為這兩種酶制劑為多種酶的復合，水解位點多造成的。在供試的酶中，胃蛋白酶水解物的ACE抑制活性始終較低。菠蘿蛋白酶水解物的ACE抑制活性在水解開始后就呈現快速上升的趨勢，在120min時達到最大(IC50=0.023mg/mL)，隨后呈現下降現象。水解度和抑制率之間沒有正相關性，這一現象與姚東瑞等[23]的研究結果一致，因此酶的選擇及工藝條件的優化在制備功能肽時是非常必要的。菠蘿蛋白酶水解物表現出較強的ACE抑制活性，因此選用菠蘿蛋白酶用于下一階段的研究。

2.2 單因素試驗

2.2.1 pH值對水解物ACE抑制率的影響

調節pH值為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，其他水解條件為：溫度50℃，加酶2000U/g pro，固液比1:3，酶解時間120min，測定酶解液水解度及其對ACE抑制率，結果如圖3所示。

圖3 pH值對水解物ACE抑制率的影響Fig.3 Effect of hydrolysis pH on ACE inhibitory rate of loach protein hydrolysates

圖2 不同蛋白酶水解物對ACE抑制率的影響Fig.2 Effect of protease type on ACE inhibitory rate of loach protein hydrolysates

由圖3可見，在試驗范圍內，隨pH值升高ACE抑制率呈下降趨勢，而水解度呈現先上升后下降的趨勢，水解度與ACE之間出現不一致的現象，水解120min的條件下，pH6時水解物對ACE的抑制活性最高，顯然此時酶并非處在最佳的作用pH值。

2.2.2 溫度對水解物ACE抑制率的影響

設定酶解溫度為40、45、50、55、60℃，pH值為6，其他條件同2.2.1節，測定酶解液水解度及ACE抑制率，結果如圖4所示。

圖4 溫度對水解物ACE抑制率的影響Fig.4 Effect of hydrolysis temperature on ACE inhibitory rate of loach protein hydrolysates

圖4顯示，溫度對水解物的ACE抑制率影響極顯著，5℃的波動即可引起ACE抑制率的較大波動，在50℃時達到最大，因此選擇50℃作為正交試驗優化時的中心水平。

2.2.3 加酶量對水解物ACE抑制率的影響

設定加酶量為500、1000、1500、2000、2500U/g pro，溫度50℃，pH6，其他條件同2.2.1節，測定酶解液水解度及其對ACE抑制率，結果如圖5所示。

圖5 加酶量對水解物ACE抑制率的影響Fig.5 Effect of enzyme dose on ACE inhibitory rate of loach protein hydrolysates

圖5顯示，水解度隨加酶量增加而提高，而ACE抑制率在水解度達到較大值時卻降低，水解度最大時的ACE抑制率并非最大，說明肽的大小對其活性的影響是非常重要的，適宜的加酶量為1000U/g pro。

2.2.4 固液比對水解物ACE抑制率的影響

設定固液比為1:1、1:2、1:3、1:4及1:5，其他酶解條件為：加酶量1000U/g pro，pH6.0，在50℃條件下酶解120min，水解度及ACE抑制率變化如圖6所示。

圖6顯示，固液比對水解物的ACE抑制率產生顯著的影響，1:4時達到最高，隨著固液比的增大，底物濃度變小，水解度及抑制率均呈下降趨勢。因此，固液比為1:4是比較適宜的，此時水解度為19.6%。

圖6 固液比對水解物ACE抑制率的影響Fig.6 Effect of solid-to-liquid ratio on ACE inhibitory rate of loach protein hydrolysates

2.2.5 酶解時間對ACE抑制率的影響

設定酶解時間為30、60、90、120、150min，固液比1:4，其他條件同2.2.4節，測定酶解液水解度及ACE抑制率，結果如圖7所示。

圖7 酶解時間對水解物ACE抑制率的影響Fig.7 Effect of hydrolysis duration on ACE inhibitory rate of loach protein hydrolysates

圖7顯示，90min時水解物的ACE抑制率達到最大。隨著酶解時間延長，雖然水解度有所提高，但水解物的ACE抑制率卻呈下降趨勢。

從單因素試驗結果來看，水解度與水解物ACE抑制率大小之間并沒有正相關關系，似乎要使ACE抑制率達到最大時，水解度應處在某一水平。這可能是因為活性肽的作用主要取決于肽鏈中暴露的氨基酸側鏈基團的性質和肽的氨基酸序列，同時，水解液的ACE抑制活性是由多種結構的肽提供的，而水解度過高或過低均可能使具有活性結構的肽含量發生變化從而使總的活性降低，這種現象與許慶陵等[24]、黃艷春等[25]的結果是一致的。

2.3 酶解工藝優化

通過SPSS 13.0軟件對單因素試驗結果進行單因素方差分析和多重比較，結果表明pH值、溫度和固液比3個因素對水解物的ACE抑制率有顯著影響。根據正交試驗設計原理，采用L9(34)正交表設計三因素三水平試驗對酶解條件進行優化。正交試驗設計及結果分析見表2。

表2 正交試驗設計及結果分析Table2 Orthogonal array design and results

表3 正交試驗結果方差分析表Table3 Analysis of variance for the experimental results of orthogonal array design

對表2試驗結果進行方差分析以確定各因素對試驗結果的影響顯著性，結果顯示(表3)，溫度對水解物的ACE抑制率影響極顯著(P＜0.01)、固液比對水解物的ACE抑制率影響顯著(P＜0.05)，而pH值對水解物的ACE抑制率影響不顯著(P＞0.05)。

表2極差分析結果顯示，影響菠蘿蛋白酶水解物的ACE抑制率的主次因素順序是A＞C＞B，即溫度＞固液比＞pH值，溫度對酶解反應的影響最大，固液比次之，pH值的影響最小。因為pH值對ACE抑制率的影響不顯著，所以最佳水解條件確定為A3B3C1，即實際水解條件為溫度55℃，固液比1:3，pH6.5，時間90min，酶用量1000U/g pro。

2.4 IC50值測定結果

采用最佳酶解條件制備水解物，將凍干后的水解物用超純水配成5mg/mL的溶液，按5倍稀釋為0.000064～5mg/mL的系列質量濃度。以質量濃度的對數為橫坐標，抑制率為縱坐標繪制量效關系圖，結果見圖8。經SPSS 13.0計算(probit模型)得泥鰍肉酶解液ACE抑制率的IC50=0.0184mg/mL。

經優化后，泥鰍蛋白水解物的ACE抑制活性顯著提高(IC50由0.023mg/mL降至0.0184mg/mL)，說明酶解條件的優化是非常必要的。在相同的條件下測得卡托普利的IC50為0.056μg/mL，泥鰍蛋白水解物的ACE抑制活性雖然低于卡托普利，但與其他食源性肽相比，泥鰍蛋白水解物的ACE抑制活性遠高于大豆肽(1.20mg/mL)[26]、銀杏蛋白水解物(0.98mg/mL)[18]、乳酪蛋白水解物(0.0528mg/mL)[27]，也遠高于其他水產源蛋白水解物[28]，例如大西洋鮭魚(Atlantic salmon)、銀鮭(coho salmon)、阿拉斯加鱈(Alaska pollock)和南方藍鱈(southern blue whiting)的IC50分別為5.00、3.70、2.90、3.60mg/mL。因此，菠蘿蛋白酶水解泥鰍蛋白制備ACE抑制肽效果是非常好的。

圖8 樣品質量濃度與ACE抑制率的量效關系圖Fig.8 Relationship between mass concentration and ACE inhibitory rate of loach protein hydrolysates

2.5 泥鰍肉水解物的相對分子質量分布

2.5.1 標準曲線

測定水解物相對分子質量分布的Sephadex G-15凝膠柱參數為V0=17.95mL，Vt=39.94mL。由各標準品的保留時間計算出相應的Ve，進而計算出有效分配系數Kav，制作標準曲線，得標準曲線回歸方程為y=-1.2895χ+4.3499，R2=0.9978。

2.5.2 泥鰍肉水解物的相對分子質量分布及ACE抑制率

圖9 泥鰍肉酶解液Sephadex G-15層析圖Fig.9 Sephadex G-15 gel filtration chromatogram of loach protein hydrolysates

圖9、10顯示，水解物中不同相對分子質量的肽段均具有一定的ACE抑制活性，但活性高低差別很大，主要活性肽的相對分子質量在924左右，而其他組分的ACE抑制活性相對較弱。這種現象可能是因為ACE是一類專一性相對較弱的酶，在蛋白質經酶解后獲得的多肽中，存在著多種ACE抑制肽類物質，這些ACE抑制肽并非是簡單的有或無[24-25]。

圖10 各分離組分的相對分子質量和ACE抑制活性Fig.10 Relative molecular mass and ACE inhibitory rate of each fraction separated by from loach protein hydrolysates Sephadex G-15 gel filtration chromatography

3 結 論

3.1 通過對泥鰍肉酶解進程及ACE抑制作用的研究發現，水解度與ACE抑制活性之間沒有正相關性，選擇適合的酶及酶解條件的優化可能是酶法制備ACE抑制肽的關鍵。

3.2 菠蘿蛋白酶是一種比較適合于酶解泥鰍肉制備具有ACE抑制活性的活性肽水解酶，在最優條件下制備的水解物具有很高的ACE抑制活性。

3.3 經正交試驗優化的最佳酶解條件為：溫度55℃，固液比1:3，pH6.5，時間90min，酶用量1000U/g pro，在該條件下水解物對ACE抑制率的IC50為0.0184mg/mL。水解液中活性肽的相對分子質量主要集中在924左右。

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Preparation of ACE Inhibitory Peptides by Bromelain Hydrolysis of Loach (Misgurnus anguillicaudatus) Protein

YAO Dong-rui，PAN Sai-kun，ZHOU Ming-qian，WANG Shu-jun，HU Jin-ling
(School of Food Engineering, Huaihai Institute of Technology, Lianyungang 222005, China)

The present deals with the enzymatic preparation of angiotensin-converting enzyme (ACE) inhibitory active peptides from loach (Misgurnus anguillicaudatus) protein. An L9(34) orthogonal array design methods based on single factor experiments was used to optimize the hydrolysis conditions for achieving maximum ACE inhibitory activity of loach protein hydrolysates. HPLC was used to determine ACE inhibitory activity of loach protein hydrolysates. Bromelain was found to be more suitable to prepare ACE inhibitory active peptides than trypsin, pepsin, flavourzyme and protamex. The optimal hydrolysis conditions were temperature of 55 ℃, solid-to-liquid ratio of 1:3, pH of 6.5, bromelain dose of 1000 U/g protein and hydrolysis duration of 90 min. The IC50 of the loach protein hydrolysate obtained under these conditions was 0.0184 mg/mL and the relative molecular weight distribution of ACE inhibitory peptides in it was mainly concentrated around 924.

Misgurnus anguillicaudatus；enzymatic hydrolysis；antihypertensive activity；angiotensin I-converting enzyme (ACE)；bromelain

Q819

A

1002-6630(2012)01-0180-06

2011-05-04

江蘇省農業科技自主創新基金項目(CX09-627；CX10-328)；連云港市科技基礎設施建設計劃項目(CK0935)；江蘇省科技支撐計劃(農業)項目(BE2010399)

姚東瑞(1966—)，男，教授，博士，研究方向為水產品加工及漁業經濟。E-mail：yao-dr@hhit.edu.cn