X型膠原在膝骨關節炎軟骨中的表達

龐金輝,劉明軒,石文俊,樊海峰,陳賢奇,唐桐生,曹成福

(上海中醫藥大學附屬普陀醫院骨科,上海,200062)

膝骨關節炎(OA)因其發病機理尚未完全明確,目前無法有效治愈。研究表明,在OA患者的關節軟骨中,軟骨細胞和各種細胞外基質均發生顯著的改變,由膠原和蛋白聚糖所組成的網絡狀結構亦出現降解,從而導致了關節軟骨的進一步退化。本實驗通過對膝OA和正常人關節軟骨中X型膠原的檢測,分析OA患者X型膠原的表達特征,以探討X型膠原在膝骨關節炎進展中所起的作用。

1 材料和方法

1.1 標本情況

收集行人工膝關節置換術患者的軟骨標本18例,所有病例均排除繼發性OA或類風濕關節炎等其他關節疾病,確診為原發性OA(診斷標準參考美國風濕病學會1995年版指南),其中女14例,男4例,平均年齡 68.3歲(61～79歲)。正常對照組13例 ,女性9例 ,男性4例 ,平均年齡65.1歲(57～81歲),來源于大腿及以上部位截肢術患者或捐獻的新鮮尸體,均無關節疾患。

1.2 實驗方法

1.2.1 HE染色:各組標本取下后,去除碎屑,生理鹽水沖洗,仔細觀察大體情況,取部分做HE染色,其余標本置于-70℃凍存待用。

1.2.2 總RNA抽提:將軟骨組織塊充分剪碎,PBS洗滌,加入0.2%的Ⅱ型膠原酶/0.1%透明質酸酶的DMEM溶液中,于37℃震蕩消化4～6 h,500 g離心獲取軟骨細胞。取軟骨細胞加入Trizol(GIBCO BRL)中,按照實驗說明抽提總RNA。余下細胞冷凍備用。

1.2.3 RT-PCR:按照試劑盒說明,將mRNA反轉錄為 cDNA(2 μ L RNA/20 μ L 體系 ,TaKaRa AMV Reverse Transcriptase XL)。以得到的cDNA為模板進行PCR反應(TaKaRa Taq),以βactin為內標基因。X型膠原的引物序列如下:正義鏈 5′-TGGGTAGGCCTGTATAAAGAACGG-3′;反 義 鏈 5′ -CATGGGAGCCACTAGGAATCCTGAGA-3′。X型膠原基因擴增反應條件:94℃變性5 min,94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,反復循環,最后72℃延伸10 min。產物的片段長度為210 bp。

1.2.4 Northern 雜交:取總 RNA 樣本 20 μ g左右,在含有2.2 mol/L甲醛的1%瓊脂糖凝膠中50 V電泳6 h左右。電泳完畢后,凝膠用DEPC水稍加淋洗,毛細洗脫法將RNA樣品轉移至尼龍膜,具體步驟按照分子克隆實驗指南進行。尼龍膜以0.12 J/cm2紫外線照射交聯。取100～200 ng探針片段,以32 P標記,加入到10 mL雜交液(CLONTECH)中,與尼龍膜68℃雜交過夜。次日,將尼龍膜置于 100 mL 1×SSC(20×SSC:3 mol/L NaCl,0.3 mol/L枸櫞酸鈉)/0.1%SDS中,42℃漂洗20 min;再用100 mL 0.2×SSC/0.1%SDS稍加漂洗。最后,磷屏顯影,進行光密度分析。

1.2.5 Western雜交:取預先留存的軟骨細胞,加入蛋白裂解液提取細胞蛋白。采用Bio-Rad DC protein assay對總蛋白濃度進行測定后,取30 μ g總蛋白,加入5×上樣緩沖液,進行體積分數10%SDS-PAGE電泳,半干轉移至硝酸纖維素膜,0.05 kg/L脫脂奶粉封閉過夜后,以1∶2 000比例加入鼠抗人X型膠原抗體,室溫作用3 h,Tween20-PBS洗膜5 min×3次,二抗孵育 2 h,同上洗膜3次后,ECL(Amersham)化學增強發光,X線片曝光,顯影。

1.3 統計學分析

采用SPSS 10.0軟件進行方差分析和相關性分析,設定P<0.05為差異有統計學意義,P<0.01差異有顯著統計學意義。

2 結 果

2.1 OA軟骨的組織學特征

與正常對照關節軟骨相比,病變軟骨無光澤,呈淡黃色,表面粗糙,有大小不一的軟骨碎裂剝脫,軟骨下骨暴露,部分有潰瘍形成。HE染色顯示軟骨基質纖維變性,部分細胞增殖活躍,存在簇聚現象。

2.2 RT-PCR檢測X型膠原表達

RT-PCR檢測X型膠原的結果發現,OA患者的關節軟骨細胞中X型膠原在mRNA水平有顯著升高。進一步對RT-PCR的結果進行光密度分析,可以發現OA組的collagen-X/β-actin的比值與正常對照的差異有顯著性(P<0.05)。

2.3 Northern雜交檢測X型膠原表達

Northern檢測結果顯示,在OA組的關節軟骨中X型膠原的表達水平非常顯著地高于正常對照組(P<0.01),OA組平均水平達到對照組的2.40倍。

2.4 Western雜交檢測X型膠原含量

在蛋白水平,Western雜交檢測結果提示,OA患者的關節軟骨基質中X型膠原的含量,與正常對照組相比顯著升高(P<0.01),有顯著的統計學差異。

2.5 X型膠原mRNA和蛋白表達變化的相關性分析

將各例OA患者的RT-PCR、Northern雜交與Western雜交結果,通過Pearson相關性分析,最終顯示mRNA與蛋白水平的X型膠原的表達水平的變動并不具有顯著的相關性(P>0.05)。

3 討 論

在正常關節的透明軟骨中,由Ⅱ、Ⅸ和Ⅺ型各種不同的膠原纖維交聯成的網絡結構提供其必要的組織強度和順應力[1]。X型膠原是一種短鏈的非纖維性膠原,由三條相同的α 1鏈組成三聚體,正常存在于軟骨化骨中心及骨骺軟骨生長板內的軟骨細胞周圍的基質中。X型膠原可以形成柵格狀的結構,并與Ⅱ型膠原纖維發生聯系,影響關節軟骨的結構和強度[2]。

骨關節炎是老年人最常見的慢性關節疾病,其發病過程中最主要的特點是關節軟骨的進行性丟失[3]。在OA患者的關節軟骨中,軟骨細胞自身的生長和增殖,及其基質的合成和代謝均出現紊亂[4]。根據本實驗的結果,無論是在mRNA水平還是在蛋白水平,OA患者的關節軟骨中X型膠原的表達都要顯著的高于正常對照組。在OA患者的關節腔中,由于炎癥反應的進行,存在各種細胞因子,如IL-1β和 TNF-α等[5-7]。分解性細胞因子和合成性細胞因子之間的平衡維持著軟骨基質合成代謝和分解代謝的平衡,二者比例的失衡是OA軟骨基質的降解和破壞的重要原因[8-9]。當周圍的生化條件發生改變,OA的關節軟骨中,軟骨細胞會失去正常表型,轉化成肥大軟骨細胞,不再表達Ⅱ型膠原,轉而大量合成X型膠原。在很多的臨床病例中,都發現OA的發生往往伴隨著X型膠原的合成和沉積,并且隨OA的病變過程,X型膠原的陽性表達會擴展向軟骨表面的纖維化區和骨贅形成的區域[10]。

經本實驗的統計學分析,我們又發現在膝OA的關節軟骨中,X型膠原在mRNA和蛋白水平表達的變化情況并沒有顯著的相關性。這種不一致性,我們認為主要是因為OA關節軟骨中細胞凋亡與基質降解的不同步性造成的。當細胞發生凋亡時,既沒有mRNA的合成,又在酶的催化作用下使原有的mRNA等生物大分子迅速降解。但與此同時,細胞外的X型膠原蛋白并不會像mRNA那樣急速的分解,因而,在各個具體的OA關節軟骨中,X型膠原的mRNA和蛋白水平表達的狀況并不是同步的。

本實驗的Northern雜交與RT-PCR結果的差別提示我們,Northern雜交是一種更為精確和可信的半定量檢測方法。由于RT-PCR歷經了2步酶反應,其間的平臺效應可能會影響到實驗結果的準確性[11]。

在臨床中,OA一般常見于老年人群,是一種較為普遍的老年性疾病。在老化過程中,軟骨細胞合成Ⅱ型膠原和X型膠原的能力逐漸變化,令基質中Ⅱ型/X型膠原的比例不斷降低。當膝OA發生后,半月板顯示有相當程度的崩解與中心的骨化,四周的軟骨基質強烈表達X型膠原,且由于結構松散易被水解。而軟骨中的膠原代謝率極低[12],當外周的基質被水解后,軟骨細胞直接與炎癥反應中的各種細胞因子接觸,大量凋亡,更加無法補償被破壞的胞外基質,從而使OA的病癥進一步惡化。

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