腰椎椎間盤退變過程中炎癥介質作用的研究進展

袁宇飛，彭寶淦

椎間盤退變(intervertebral disk degeneration，IVDD)的過程伴隨著生物力學和形態學的改變。腰椎椎間盤退變是導致下腰痛及神經根痛的主要病因并且嚴重的退變可以引起失能，但是其發病的病理生理學機制仍然不是非常清楚。1934年，Mixter等［1］首次證明了椎間盤組織突出到椎管中壓迫和刺激神經根可以引起坐骨神經痛癥狀。這只能部分解釋神經根痛的病理生理機制。IVDD 是椎間盤細胞及細胞外基質減少的一種連續性改變。炎癥反應是IVDD 的重要因素。

椎間盤是人體內最大的封閉和無血管組織并且有很高機械壓力和靜水壓力，極度缺氧且營養供應非常有限。椎間盤的無血管性防止了纖維蛋白的沉積有利于軟組織的修復，但是椎間盤微弱的修復能力導致了椎間盤損傷的積累和由促炎細胞因子和蛋白水解酶等介導的慢性炎癥的發生［2］。顯微鏡下觀察，IVDD 有一些特征性的改變，比如細胞凋亡、增殖、黏液性的退變、顆粒狀的改變和神經、血管的長入。在椎間盤源性腰痛患者的疼痛椎間盤中可以觀察到沿著纖維環裂隙長入髓核的血管生成［3］。從手術中切除的椎間盤可以看出活躍的炎癥反應過程是由外向內進行的，而且動物實驗也證實了有效的修復只發生在外層纖維環和終板，而這里是細胞密度最高和代謝最活躍的地方［4-5］。Kang 等［6］在突出的椎間盤中發現了一系列的炎癥細胞因子，包括基質金屬蛋白酶類(matrix metalloproteinases，MMPs)、NO、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)，前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)。退變的炎癥級聯反應最終將導致廣泛的結構缺陷和正常運動節段功能和結構的喪失。大量研究表明大量的炎癥介質在IVDD 的始動、進展以及炎癥的消除方面起著平衡的作用。

1 腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)

在退變及突出的椎間盤中，TNF-α 存在于組織細胞，纖維組織，內皮細胞，和軟骨細胞。TNF-α 通過旁分泌或者自分泌的方式作用于TNF 受體，包括Ⅰ型(p55)和Ⅱ型(p75)。TNF-α 是可以引起神經根放射痛及IVDD 的炎性介質［7］。Sinclair 等［8］將15 名患者的退變椎間盤取出進行體外實驗，分為TNF-α 培養組和陰性對照組，實驗組中加入不同劑量的TNFⅡ型受體(TNF receptor Ⅱ，TNF-RⅡ)，結果發現相對于對照組TNF-α 可以顯著性增加NO，PGE2 和IL-6 的分泌。在加入少量的TNF-RⅡ后NO，PGE2 的產生顯著減少，并呈劑量相關性，但是IL-6 的量并未改變。微量的TNF-RⅡ就可以明顯的減弱TNF-α 的誘導作用，表明TNF 受體是有效的TNF 拮抗劑并且可以減弱退變椎間盤的炎癥反應。不難推測TNF 受體及其類似物可以用于IVDD 的臨床治療。Bachmeier 等［9］用人尸體的椎間盤做實驗，通過免疫組化的方法分析TNF-α 和TNF-R Ⅰ和TNF-RⅡ、TNF-α 轉換酶的表達和定位，發現這4 項指標從年輕人(18歲)開始就有顯著性的表達，并且主要分布在髓核，在老年人的椎間盤髓核中有輕度的降低，在纖維環中表達明顯減少，表明隨著年齡的增加，椎間盤中TNF-α 的含量增加并且與IVDD 相關。TNF-α 被TNF-轉換酶活化而且通過受體而發揮生物學活性。Kobayashi 等［10］建立大鼠腰椎椎間盤突出模型，分別將5 羥色胺(5-hydroxytrypta mine，5HT)，TNF，5-HT+TNF 注射入大鼠椎間盤內，觀察大鼠的后爪痛覺敏感性，證實了5-HT 和TNF 可以誘導疼痛并且二者相互作用可以延長疼痛時間。Yamashita 等［11］通過動物實驗研究證明TNF-α 可以通過長期的刺激而引起背根神經節病理改變而引起根性痛。另外在脊柱韌帶的一些成纖維細胞中也有TNF-α 的表達。張林華等［12］將纖維環破裂組、纖維環未破裂組與對照組相比較，結果發現TNF-α 和IL-1β 的含量在纖維環破裂組明顯高于纖維環未破裂組，且兩者都高于對照組，證明:TNF-α 和IL-1β均可能參與了人類椎間盤組織的退變過程。Ulrich等［13］通過針刺法制造大鼠IVDD 模型，觀察到了IL-1和TNF-α 持續的增高。Takada 等［14］制造動物自體髓核移植模型，用PCR 的方法檢測到自體髓核移植后TNF-α，IL-6，IL-8 和環氧化酶(cyclooxygenase-2，COX-2)表達的上調及短時間內的巨噬細胞灌注，并觀察到TNF-α 和IL-8 的中和顯著的增加了大鼠后爪的疼痛閾值。在椎間盤-巨噬細胞的相互作用下IL-6 和PGE2 的產生需要TNF-α 的誘導;TNF-α和IL-8 的中和可能將是椎間盤突出的有效治療方式。

2 PGE2

PGE2 在引起神經根病方面起主要作用。花生四烯酸的級聯反應可以合成PGE2，合成過程主要由2 種酶調節，磷脂酶A2(phospholipaseA2，PLA2)和COX-2。PLA2 是這個級聯反應的限速酶。PG 和白三烯是重要的炎癥介質可以導致組織損傷及產生疼痛、降低疼痛閾值。PGE2 可以提高其他致痛物質的敏感性，比如緩激肽。Vo 等［15］的研究發現PGE2可以減少椎間盤細胞蛋白聚糖的合成，并且呈劑量依賴性。用半定量RT-PCR 的方法檢測椎間盤細胞中關鍵基質結構基因、聚集蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖、Ⅰ和Ⅱ型膠原的表達。結果發現PGE2 可以降低抗分解代謝分子基質金屬蛋白酶組織抑制劑-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)的mRNA 的表達，但是PGF2α 增加分解代謝分子MMP-1 和MMP-2 的mRNA 的表達。因此得出結論PGE2 和PGF2α 可能在保持細胞外基質的穩態方面起消極影響。

3 NO

NO 最初發現是內皮細胞分泌的舒張因子，而且是一種重要的血管活性物質;NO 是IVDD 中新型的介質，NO 可以通過抑制PGE2 合酶，血栓素，IL-6而起到抗炎的作用。在骨科手術領域，Farrell 等［16］首先證明了在風濕性關節炎和骨關節炎患者的滑液中NO 的含量較高，表明NO 的產生和關節炎的發病機制有密切關系。徐宏光等［17］向大鼠的椎間盤內注射L-精氨酸制造動物模型，術后3周觀察X 線片顯示實驗組椎體不穩較對照組明顯減輕，證明了內源性NO 的產生可能有助于減輕椎間盤的退變。Liu 等［18］的實驗研究證明NO 可以抑制椎間盤中蛋白聚糖酶的合成，靜水力學壓力可以影響椎間盤細胞NO 的分泌，因此推測在機械壓力下NO 在椎間盤細胞代謝及IVDD 過程中起重要作用。提示NO可能參與了椎間盤的退變過程。深入研究腰椎退變性疾病不同階段中，NO 的產生和NOS 活性改變的機制將有助于新的治療方法的出現。

4 IL-1

1988年Shinmei 等［19］第1 次在兔的IVDD 實驗模型中觀察到了IL-1。正常的椎間盤細胞可以表達IL-1 的2 種亞型(IL-1α，IL-1β)。在正常及退變的椎間盤中IL-1 都是基質酶的關鍵調節劑。Hoyland 等［20］的研究證明IL-1 是椎間盤中調節基質退變一個關鍵的細胞因子。Le Maitre 等［21］的研究表明在椎間盤細胞中IL-1 可以增加MMP-3、MMP-13、解整鏈蛋白金屬蛋白酶-4(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs-4，ADAMTS-4)基因的表達，而且可以減少細胞基質基因(聚集蛋白聚糖、膠原蛋白Ⅱ和膠原蛋白Ⅰ)的表達，證明抑制IL-1 的產生可以預防甚至逆轉IVDD。Gorth等［22］將IL-1 受體拮抗劑(IL-1 receptor antagonist，IL-1Ra)與聚乳酸-羥基乙酸共聚物［poly(lactic-coglycolic acid)，PLGA］制成微球體注射入椎間盤中觀察髓核的退變情況，結果發現IL-1Ra 微球體可以較長期的減輕髓核退變。這種細胞因子介導的治療方法可以用于早期IVDD 的治療。此類研究還處于體內模型階段，隨著研究的成熟又是一項非手術治療方法。Gilbert 等［23］將新鮮尸體退變和未退變的椎間盤取出后將纖維環分離出，分為暴露或不暴露于IL-1Ra 和IL-4 受體抗體(IL-4 receptor antibody，IL-4RAb)并給與CTS10%的拉緊度1.0 Hz 持續20 min，分別于1 h 和24 h 后行tr-PCR 檢測聚集蛋白聚糖和Ⅰ型膠原、MMP-3、ADAMTS-4 的基因表達情況，結果發現未退變椎間盤的纖維環細胞MMP-3 和ADAMTS-4 的基因表達降低，而經過IL-1Ra 和IL-4RAb 預處理的纖維環細胞基因的表達則未減低;而退變的纖維環細胞無論有無經過IL-1Ra 和IL-4RAb 預處理聚集蛋白聚糖和Ⅰ型膠原的基因表達都降低。證明退變椎間盤的纖維環細胞可能在機械力傳導方面不受椎間盤內的細胞因子的影響，可能還有另一條傳導通路在運行。

5 IL-6

IL-6 主要由神經元細胞，膠質細胞，造血前體細胞，T 細胞，B 細胞，角蛋白細胞和破骨細胞分泌，而且是炎癥反應的重要介質。IL-6 感受器是由IL-6R和信號轉導亞基(gp 130)組成。通過刺激TNF-α，可以使IL-6 的產生明顯增加。在人類的關節軟骨中，IL-6 可以抑制蛋白聚多糖的產生，蛋白聚多糖在正常椎間盤的髓核組織中的含量很高而且可以阻止血管和淋巴管的內生長。IL-6 可以上調MMP 抑制劑的產生。Studer 等［24］的實驗研究證明在退變的椎間盤中IL-6 可以增加PGE2 和MPP-3 的合成，證明IL-6 可以促進椎間盤的退變。Burke 等［25］研究發現椎間盤源性下腰痛的病人的髓核標本可以產生高水平的促炎介質比如IL-6 和IL-8。IL-6 在促炎和抗炎的細胞因子中起到了中介的作用。進一步的研究還有待闡明IL-6 在引起神經根痛方面的具體機制。

6 IL-10

IL-10 是一種抗炎因子和免疫抑制細胞因子。許多細胞包括巨噬細胞可以產生IL-10。Holm 等［26］建立豬的IVDD 模型，3 個月的時候IL-10 在退變的椎間盤較對照組有輕度的升高，表明IL-10 參與了椎間盤的退變過程。IL-10 可以有效的抑制巨噬細胞釋放TNF-α。盡管IL-10 有非常明顯的抗炎(抗TNF)作用，但是Ahn等［27］的一項研究用RT-PCR 的方法在23 個突出的椎間盤標本中只有2 個(9%)檢測到了IL-10 mRNA。Lin等［28］調查中國人群中IL-10 基因啟動區域單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)與腰椎IVDD 的易感性和嚴重性的關系，Logistic 回歸分析表明AA 在－1082，－592 位點及IL-10mRNA 的表達水平是IDD 的獨立危險因素，推論IL-10 基因啟動區的SNPs 位點的－1082 A/G、－592 A/C 及IL-10 mRNA與腰椎IVDD 的易感性有關而與嚴重性無關。

7 IL-17

在退變及突出的椎間盤組織中可以觀察到IL-17和IFN-γ 和TNF-α 的含量協同提高，表明這些細胞因子在椎間盤疾病中起到了一定的作用。Gabr等［29］將IVDD 和脊柱側凸的患者的椎間盤取出，在IL-17 和干擾素-γ(Interferon-γ，IFN-γ)和TNF-α 的共同刺激下觀察NO、PGE2、IL-6 和細胞間粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)的表達，結果發現這些細胞因子的分泌呈顯著性增加。IL-17、IFN-γ 和TNF-α 在炎癥介質釋放及ICAM-1表達方面起協同效應。這些發現表明椎間盤細胞還可以表達表面配體招募淋巴細胞和免疫細胞到椎間盤的微環境中。而IL-17 可能起到了重要的炎癥反應調節劑的作用。

8 其他的細胞炎性因子

Jung 等［30］制造大鼠動物模型并觀察大鼠的疼痛行為，挑選明顯疼痛的大鼠用RT-PCR 的方法檢測背根神經節(dorsal root ganglion，DRG)及丘腦中的一系列與疼痛相關的細胞因子的基因表達，結果發現在第4 和第8周時DRG 中的TNF-α、和IL-1β顯著升高，在第6周時DRG 中的IL-6 明顯升高，但是這些細胞因子在丘腦中的并沒有顯著改變，降鈣素基因相關肽和P 物質分別在第4 及第8周DRG中及第2 和第4周丘腦中顯著增加。第2周時DRG和丘腦中可以觀察到膠質細胞源性神經營養因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)顯著增加并且持續到底8周。DRG 及丘腦中GDNF的持續升高表明GDNF 可能是慢性椎間盤疼痛的關鍵因子。

Omlor 等［5］用12 只成年小型豬做實驗，將36個椎間盤行部分髓核摘除術，其中24 個椎間盤術后給與透明質酸移植，術后24周將動物處死并用X線、MRI 觀察2組椎間盤的高度及退變情況并作組織學及基因表達分析，結果發現2組椎間盤高度降低的程度及MRI 信號強度減低程度相同，2組的髓核組織退變分數較對照組顯著降低，且椎間盤經過HA 治療后局部纖維環出現更多的瘢痕及炎癥反應，MMPs 的基因表達上調，但是IFN-γ，IL-6，及IL-1β的表達沒有改變，證明髓核的炎癥及纖維環的損傷及瘢痕可以導致椎間盤的退變，由此可見治療的重點應該集中在防止纖維環的損傷或者修復損傷的纖維環以保持椎間盤的完整性方面。

9 IVDD 的生物學治療

近年來學者們對臨床癥狀與IVDD 的關系的研究較多，而致力于椎間盤再生的研究較少。患者在非手術治療無效后大多數面臨的就是手術治療。現在的手術方式多是行椎間盤切除及椎體融合手術，短期內可以緩解癥狀，但是這將導致脊柱生物力學的改變及鄰近節段椎間盤的退變等手術并發癥。一些新的手術治療方式比如人工椎間盤置換還存在爭議，因為假體的置入可以部分的干擾椎間盤的結構可能最終會導致運動節段的不穩。那么可以減輕臨床癥狀及阻止甚至逆轉IVDD 的生物學療法，比如間充質干細胞移植、椎間盤注射合成代謝生長因子、基因療法可能將會解決這些不足［31］。

Leckie 等［32］將34 只成年新西蘭大白兔的L2/L3/L4/L5行環形切開術制造IVDD 模型，然后將腺相關病毒-2(adeno-associated virus，AAV2)載體攜帶基因骨形態發生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)或者TIMP-1 注射入治療組的退變椎間盤中與無針刺假手術組及針刺對照組做比較。各組分別在即時，第6周和第12周時行MRI 檢查以確定IVDD 情況;在第12周時處死動物，L4/L5椎間盤行組織化學分析，檢測L3/L4椎間盤的粘彈性。結果發現針刺組的MRI 和組織學表現為退變表現，治療組的MRI 和組織學退變證據較針刺組較輕。生化標記物C-端肽Ⅱ型膠原在針刺組中明顯升高，治療組在術后12周時又返回到對照值。證明椎間盤中注射AAV2-BMP2 或者AAV2-TIMP1 可以延緩椎間盤的退行性改變。

Liang 等［33］將用針刺法制造大鼠的IVDD 模型，2組大鼠隨機接受腺病毒攜帶的熒光素酶基因和生長分化因子-5(growth differentiation factor-5，GDF-5)，前者即Ad-Luc組，后者即Ad-GDF5組。術后在不同時間點行X 線、MRI 及組織學和生物化學檢測。結果顯示在第6 和8周時Ad-GDF5組MRI T2 加權像可以看到有高信號，但是Ad-Luc組未觀察到;在第2周時Ad-GDF5組的椎間盤高度指數較Ad-Luc組顯著增加;術后第2周以后Ad-Luc組的糖胺聚糖(glycosaminoglycan，GAG)明顯減低，術后第4周DNA 的含量開始減低，Ad-GDF5組一直到術后8周都沒有檢測到GAG 和DNA 的減低。證明腺病毒是一種有效的基因載體，Ad-GDF5 基因療法可以修復損傷椎間盤，而且有可能成為IVDD 的一種有效的治療方式。

Kim 等［34］將行腰椎椎間盤切除手術患者的退變椎間盤取出并將髓核、纖維環和移行帶分開，暴露于BMP-2，結果發現BMP-2 可以促進纖維環細胞的有絲分裂，及髓核細胞蛋白聚糖的合成。但是在椎間盤的任何區域都未見BMP-2 的成骨效應。可見BMP-2 可以用作同化激素類藥物來促進纖維環的有絲分裂，而且可以使髓核細胞基質在沒有骨生成的情況下再生。動物實驗證明向椎間盤中注射BMP-7和BMP-14，在恢復椎間盤的結構方面是有效的［35］。

椎間盤的退變與細胞外基質的降解有關，而椎間盤的修復需要細胞外基質的產生及蛋白水解酶活性的下調。而這些特性是與一些生長因子有關的。一些合成肽比如Link N，在體外實驗中可以刺激椎間盤細胞中蛋白聚糖和膠原的合成。Mwale 等［36］將28 只新西蘭大白兔用針刺法制造L3/L4/L5節段IVDD 模型，術后2周2 個節段分別注射Link N 和生理鹽水，2周后處死9 只動物將椎間盤取出，用PCR 的方法檢測聚集蛋白聚糖、ADAMTS-4，ADAMTS-5 和MMP-3 等;12周后處死19 只動物并將椎間盤取出做生化和組織學分析。術后每2周用X線檢測一次椎間盤的高度。結果發現術后2周是椎間盤的高度下降了25%，而隨后的觀察中發現Link N組的椎間盤高度可以部分恢復。術后髓核和纖維環中的蛋白聚糖含量減少，但是Link N組有部分恢復的趨勢。Link N 不能改變椎間盤中DNA 的含量。Link N組相對于鹽水組可以使髓核和纖維環中聚集蛋白聚糖基因表達顯著增加，而蛋白水解酶基因表達顯著降低。證明Link N 可以增加椎間盤中蛋白聚糖的含量，有助于退變椎間盤的修復，Link N將會是治療IVDD 的方法之一。

Li 等［37］認為大黃酸可以提高細胞外基質的合成并且可以抑制炎癥反應。盡管在IVDD 過程中有細胞外基質的退變及炎癥反應，但是基于大黃酸的生物活性，大黃酸可能是一個很有治療前景的生物學治療藥物。另外，根據大黃酸的作用機制，大黃酸可能會減少IL-1 引起的細胞凋亡，抑制MMPs 和蛋白聚糖酶的分泌。

但是對細胞生物學、椎間盤細胞再生、IVDD 的病理學研究的有限性成為生物工程療法介入臨床治療的障礙。這些治療方法大多處于動物實驗階段，且許多安全性問題需要解決。但隨著生物學治療的發展及IVDD 病因研究的深入，生物學治療將在IVDD 疾病的治療方面發揮重要作用。

綜上所述，炎性反應在IVDD 性疾病中發揮著重要作用，但是兩者的相互關系尚需進一步研究。椎間盤退行性病變病因的進一步闡明有助于改善神經功能的新的治療方法的產生，進而減輕患者的病痛。如果能延緩甚至阻止椎間盤的退變過程就有可能減輕患者的腰腿痛癥狀。在已有研究的基礎上有待于更深入的研究，以指導臨床對椎間盤退行性病變的預防和治療。

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